β-arrestin-1敲除小鼠中縮膽囊素對胰島β細(xì)胞的作用及機(jī)制.pdf

1、Arrestins是一組具有重要作用的蛋白。它可調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Arrestin同G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合使G蛋白介導(dǎo)的信號通路被阻斷，且介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體的內(nèi)吞;Arrestin還啟動(dòng)新的非G蛋白依賴的信號途徑，例如ERK和Src等信號途徑。除了結(jié)合GPCR，arrestin可以同許多細(xì)胞表面受體家族及多種信號途徑蛋白結(jié)合。
　　哺乳動(dòng)物表達(dá)arrestin的四種亞型，其中β-arrestin-1和β-arrest

2、in-2的表達(dá)在哺乳動(dòng)物中十分廣泛，并且具有十分重要的功能。為了研究β-arrestin-1和β-arrestin-2的生理功能，β-arrestin-1和β-arrestin-2兩種基因敲除小鼠被廣泛應(yīng)用。目前，應(yīng)用β-arrestin-1和β-arrestin-2的基因敲除小鼠，研究許多生理問題:G蛋白偶聯(lián)受體受到相關(guān)激素或配體刺激后，下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控;各系統(tǒng)器官的發(fā)育及功能的維持;各種疾病及外界環(huán)境刺激所致疾病的轉(zhuǎn)歸等。其中較

3、多的研究結(jié)果來自于β-arrestin-2基因敲除小鼠，而對β-arrestin-1基因敲除小鼠的研究較少。
　　本實(shí)驗(yàn)室的前期胰島β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，β-arrestin-1在硫化縮膽囊素八肽(CCK-8s)抗β細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用;為了研究CCK-8s對原代胰島β細(xì)胞的作用，我們通過β-arrestin-1的敲除小鼠的胰島和胰島β細(xì)胞，證實(shí)了β-arrestin-1在CCK-8s結(jié)合CCK1受體進(jìn)而促進(jìn)胰島素分泌

4、及抗胰島β細(xì)胞凋亡中的作用。研究胰島β細(xì)胞中CCK1受體激活后不同下游通路的偏向性，對開發(fā)新的抗糖尿病藥物奠定了基礎(chǔ)。
　　目的：
　　運(yùn)用β-arrestin-1敲除小鼠，研究CCK-8s對胰島β細(xì)胞凋亡和胰島素分泌的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)用基因敲除小鼠及野生型小鼠的準(zhǔn)備
　　(1)純合敲基因小鼠同C57小鼠的回交。
　　(2)F1代雜合小鼠的選育及配種。
　　(3)逆轉(zhuǎn)錄PC

5、R區(qū)分野生型及非野生型F2代小鼠。
　　(4)實(shí)時(shí)定量PCR區(qū)分F2代雜合及純合小鼠。
　　(5)以上述方法擴(kuò)大種群數(shù)量，選取同窩野生及純合基因敲除小鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　(1)使用ELISA試劑盒檢測β-arrestin-1敲除小鼠和野生C57小鼠胰島給予CCK-8s后胰島素分泌的變化。
　　(2)使用ELISA試劑盒檢測β-arrestin-1敲除小鼠和野生C57小鼠胰島給予CCK-8

6、s后IP3，cAMP的變化。
　　(3)β-arrestin-1敲除小鼠和野生C57小鼠STZ糖尿病造模，期間給予CCK-8s，驗(yàn)證β-arrestin-1同CCK-8s保護(hù)作用是否相關(guān)。
　　(4)用蛋白印記分析技術(shù)(Western blot)檢測β-arrestin-1敲除小鼠和野生C57小鼠胰島抗凋亡途徑。
　　結(jié)果：
　　β-arrestin-1基因敲除小鼠的胰島同野生型小鼠胰島相比，在受到CCK-8s刺

7、激后，分泌胰島素的量減少。
　　β-arrestin-1基因敲除小鼠的胰島同野生型小鼠胰島相比，CCK-8s通過激活CCK1受體引起cAMP的累積效應(yīng)下降。
　　CCK-8能改善STZ糖尿病造模的C57野生型小鼠的葡萄糖耐量，但不能改善β-arrestin-1敲除小鼠經(jīng)STZ糖尿病造模后的糖耐量。
　　Western blot顯示，β-arrestin-1基因敲除小鼠的胰島同野生型小鼠胰島相比，CCK-8s引起p90R