芍藥ACO和ACS基因在大腸桿菌中的高效表達(dá).pdf

1、芍藥是中國(guó)的傳統(tǒng)名花，適宜做切花應(yīng)用。由于芍藥花期短且集中，影響了它的應(yīng)用價(jià)值。乙烯在切花衰老進(jìn)程中起著重要作用。ACO和ACS是乙烯生物合成中兩個(gè)關(guān)鍵酶。為了更深入地研究芍藥 ACO和 ACS的酶學(xué)性質(zhì)以及 ACO和 ACS蛋白在芍藥切花不同發(fā)育階段及不同組織中表達(dá)豐度的變化，有必要開(kāi)展ACO和ACS原核高效表達(dá)研究。本論文成功構(gòu)建兩種ACO和ACS基因的原核表達(dá)載體；構(gòu)建的原核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)和E.

2、 coli M15菌株獲得表達(dá)菌株，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)高效表達(dá)芍藥 ACO和 ACS重組蛋白；對(duì) ACO和 ACS蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)體系進(jìn)行優(yōu)化；低溫條件下誘導(dǎo)可溶性 ACO重組蛋白；金屬螯合親和層析柱純化 ACO重組蛋白并對(duì)重組蛋白活性進(jìn)行測(cè)定。研究結(jié)果如下：
　　1.經(jīng)EcoR V/Xho I和BamH I/Hind III雙酶切鑒定成功構(gòu)建了芍藥ACO和ACS基因原核表達(dá)載體pET-32a-ACO和pET-32a-ACS。

3、芍藥ACO和ACS原核表達(dá)載體pET-32a-ACO和pET-32a-ACS轉(zhuǎn)化宿主菌E. coli BL21(DE3)獲得了基因工程菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)高效表達(dá)了芍藥ACO和ACS重組蛋白。對(duì)ACO和ACS蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)體系進(jìn)行優(yōu)化：誘導(dǎo)劑 IPTG濃度0.1 mmol/L至0.9 mmol/L均能有效誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，其有效濃度為0.4 mmol/L；當(dāng)宿主菌A600為0.3至0.6時(shí)添加IPTG，其表達(dá)量最高；基因工程菌經(jīng)

4、 IPTG誘導(dǎo)2 min后即表達(dá)重組蛋白，并隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加表達(dá)量隨之增加，誘導(dǎo)培養(yǎng)2h后其表達(dá)量趨于穩(wěn)定。37oC條件下原核高效表達(dá)的重組芍藥ACO蛋白幾乎完全以包涵體形式存在，無(wú)生物活性?；蚬こ叹?ACO經(jīng)誘導(dǎo)溫度（28oC、23oC、16oC）篩選下，最終在低溫（16oC）IPTG誘導(dǎo)表達(dá)12 h，在菌體裂解上清液中獲得了有生物活性的 ACO重組蛋白。經(jīng)金屬螯合親和層析柱純化獲得了含6×His標(biāo)簽的ACO融合蛋白。而以包涵體形