HIV-GP41蛋白在大腸桿菌中表達(dá)研究.pdf

1、HIV-1 GP41跨膜蛋白是一種極為重要的HIV檢測(cè)抗原,由于其抗原決定簇的序列較為保守,所以在HIV檢測(cè)中作為一項(xiàng)主要指標(biāo).一些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)gp41基因在E.coli中不能有效表達(dá),但其中確切機(jī)制未見文獻(xiàn)報(bào)道.據(jù)此該文就HIV-1-GP41蛋白在大腸桿菌中難以表達(dá)的原因進(jìn)行了如下探索:1.該實(shí)驗(yàn)前期工作發(fā)現(xiàn)HIV-gp41全長(zhǎng),N端2/3片斷均不能在大腸桿菌中有效表達(dá).對(duì)GP41蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)其N端融合肽及跨膜區(qū)均可形成典型

2、的穿膜螺旋結(jié)構(gòu).2.在此試驗(yàn)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,分別從FN1片斷的N端(融合肽),2/3片斷的C端進(jìn)行系列缺失,構(gòu)建不同缺失片斷表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),以期找出影響N端2/3片斷表達(dá)的更精確的氨基酸序列.蛋白表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn),N端融合肽中6個(gè)氨基酸和跨膜區(qū)中10個(gè)氨基酸是影響其表達(dá)的關(guān)鍵序列.3.綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇FN1,N3,C三個(gè)片斷進(jìn)行突變:FN1分別選擇N端融合肽中的三個(gè)疏水性氨基酸,近跨膜區(qū)中四個(gè)保守的色氨酸進(jìn)行突變;N3片斷選擇跨膜

3、區(qū)中的疏水氨基酸及保守的精氨酸進(jìn)行突變;C片斷選擇LLP1,LLP2中的部分保守的精氨酸和一個(gè)脯氨酸進(jìn)行突變.4.試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)能改善某些片斷表達(dá)對(duì)宿主菌的毒性作用,活菌計(jì)數(shù)顯示37℃誘導(dǎo)條件下宿主菌大量死亡,而低溫條件下宿主菌僅少量死亡;[3H]尿嘧啶釋放實(shí)驗(yàn)也顯示誘導(dǎo)后宿主菌在低溫條件下的釋放量遠(yuǎn)低于37℃條件.說(shuō)明低溫誘導(dǎo)表達(dá)降低了目的蛋白表達(dá)對(duì)宿主菌細(xì)胞膜的毒性作用而使其獲得有效表達(dá).因而通過(guò)低溫誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)GP41蛋白分段