HIV-GP41蛋白在大腸桿菌中表達研究.pdf

1、HIV-1 GP41跨膜蛋白是一種極為重要的HIV檢測抗原,由于其抗原決定簇的序列較為保守,所以在HIV檢測中作為一項主要指標.一些實驗發(fā)現全長gp41基因在E.coli中不能有效表達,但其中確切機制未見文獻報道.據此該文就HIV-1-GP41蛋白在大腸桿菌中難以表達的原因進行了如下探索:1.該實驗前期工作發(fā)現HIV-gp41全長,N端2/3片斷均不能在大腸桿菌中有效表達.對GP41蛋白二級結構預測,發(fā)現其N端融合肽及跨膜區(qū)均可形成典型

2、的穿膜螺旋結構.2.在此試驗結構的基礎上,分別從FN1片斷的N端(融合肽),2/3片斷的C端進行系列缺失,構建不同缺失片斷表達質粒進行誘導表達,以期找出影響N端2/3片斷表達的更精確的氨基酸序列.蛋白表達結果發(fā)現,N端融合肽中6個氨基酸和跨膜區(qū)中10個氨基酸是影響其表達的關鍵序列.3.綜合上述實驗結果,選擇FN1,N3,C三個片斷進行突變:FN1分別選擇N端融合肽中的三個疏水性氨基酸,近跨膜區(qū)中四個保守的色氨酸進行突變;N3片斷選擇跨膜

3、區(qū)中的疏水氨基酸及保守的精氨酸進行突變;C片斷選擇LLP1,LLP2中的部分保守的精氨酸和一個脯氨酸進行突變.4.試驗中發(fā)現低溫誘導能改善某些片斷表達對宿主菌的毒性作用,活菌計數顯示37℃誘導條件下宿主菌大量死亡,而低溫條件下宿主菌僅少量死亡;[3H]尿嘧啶釋放實驗也顯示誘導后宿主菌在低溫條件下的釋放量遠低于37℃條件.說明低溫誘導表達降低了目的蛋白表達對宿主菌細胞膜的毒性作用而使其獲得有效表達.因而通過低溫誘導實現全長GP41蛋白分段