丙型肝炎病毒核心蛋白在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達.pdf

1、丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)感染是導致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要原因之一。目前尚無有效的疫苗及治療藥物，對HCV感染的早期診斷是控制HCV傳播的重要手段。 HCV感染的臨床診斷途徑有：檢測血清HCVRNA、HCV抗體及HCV抗原。目前PCR檢測HCVRNA是HCV診斷最靈敏、特異的方法，但其操作復雜，易造成污染，且價格昂貴，不適于大規(guī)模的篩查應用。HCV患者血清中HCV抗原水平很低，常規(guī)免疫學方法難以

2、獲得陽性結果。故HCV診斷最常用的方法是利用HCV特異性蛋白質抗原來篩查血清中HCV抗體。 HCV核心蛋白(Core蛋白)高度保守且有很強的免疫原性，可誘發(fā)高水平的特異性體液免疫及細胞免疫，是HCV診斷試劑中必不可少的組分之一。近年來Core蛋白先后在大腸桿菌中獲得了表達，但是大腸桿菌不具有真核生物的基因表達調控機制和蛋白質的加工修飾能力，表達的蛋白往往形成的包涵體，需要經過變性、復性等處理才能應用。與大腸桿菌相比，畢赤酵母是單

3、細胞真核生物，既具有生長快的特點，又能有效克服大腸桿菌系統(tǒng)缺乏蛋白翻譯后加工、修飾的不足，表達外源蛋白可分泌到胞外，便于產品的分離純化。因此本研究在大腸桿菌系統(tǒng)中表達Core蛋白并構建其畢赤酵母表達系統(tǒng)，初步對兩個系統(tǒng)表達的Core蛋白進行對比。 將克隆有Core基因的原核表達載體pBVIL1-Core轉化大腸桿菌HB101，溫度誘導表達Core蛋白，進行SDS-PAGE及Western-Blot分析；同時通過PCR方法擴增Co

4、re基因，克隆入表達載體pPICZaA，篩選陽性克隆pPICZaA-Core。將經過酶切鑒定和測序正確的陽性克隆電轉入畢赤酵母GS115中，挑取酵母轉化單菌落，接種于BMGY培養(yǎng)基，30℃、250r/min培養(yǎng)至OD600=2.0時室溫1,500r/min離心5min，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體使OD600=1.0，重新放入搖床進行誘導。每24h補加甲醇至終濃度為1.0％，連續(xù)誘導72h，誘導后上清進行Western-Blot分析。

5、 結果顯示pBVIL1-Core的表達產物經SDS-PAGE分析出現(xiàn)一條約31KD的帶，與預期融合蛋白的分子量相符，表達蛋白存在于包涵體中且表達量占菌體總蛋白的20％，Western-blot顯示誘導后菌體在相應位置出現(xiàn)特異性雜交帶，表明在大腸桿菌中以包涵體的形式表達了Core蛋白；以PCR方法從質粒PBRTM/HCV中擴增出一條369bp的片斷，經測序與文獻一致。Western-Blot分析pPICZaA-Core轉化酵母菌誘導72