植物乳桿菌ZJ316黏附蛋白基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、乳酸菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)微生物菌群，益生性的乳酸菌在機(jī)體內(nèi)有調(diào)節(jié)人和動(dòng)物體微生態(tài)平衡，抑制并殺死致病菌，增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用。黏附是乳酸菌定植于宿主腸道發(fā)揮各種生理作用的前提。研究乳酸菌的黏附機(jī)制對(duì)于微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有重要的研究意義。
　　 本研究以本實(shí)驗(yàn)室保存的從嬰兒糞便中篩選得到的一株產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ZJ316）為研究對(duì)象。采用微生物黏著碳?xì)浠衔锓?MATH)

2、測(cè)定了三株乳酸菌（植物乳桿菌ZJ316、植物乳桿菌ZJ22、屎腸球菌ZJ19）疏水性、表面電荷和自聚合能力等表面性質(zhì)，并且進(jìn)行了酵母凝集實(shí)驗(yàn)測(cè)定乳酸菌的糖類專一性。結(jié)果顯示，植物乳桿菌ZJ316的疏水性最高(83.67±1.13)。酵母凝集實(shí)驗(yàn)表明植物乳桿菌ZJ316的酵母凝集度為32，加入了D-甘露糖和甲基-α-D-甘露糖苷的的實(shí)驗(yàn)組，乳酸菌的黏附力下降，說(shuō)明植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumZJ316）的黏附

3、與特異性黏附中的甘露糖結(jié)合相關(guān)聯(lián)。
　　 以Lactobacillus plantarum WCFS1表層黏附蛋白Slp2588、黏液黏附蛋白Muc2486黏附蛋白基因序列(1062815)、(1062646)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，在Lactobacillus plantarumZJ316中，克隆黏附基因并進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果為:基因片段slp2588A長(zhǎng)度為1618 bp，基因片段muc2486A長(zhǎng)度為3018 bp。在NCBI網(wǎng)站用B

4、LAST軟件相似性比較，結(jié)果顯示，基因片段slp2588A和Lactobacillus plantarum WCFS1中的黏附基因slp2588相似性為98％;基因片段muc2486A和L.plantarumWCFS1中的黏附基因muc2486相似性為99％。因此，我們初步判斷在植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ZJ316基因組中存在表層黏附蛋白Slp2588和粘液黏附蛋白Muc2486基因序列。
　　

5、 將含有相同黏性末端的目的片段（slp2588A、muc2486A）與質(zhì)粒載體(pET-28a)體外重組構(gòu)建原核表達(dá)載體。將重組載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示有目的蛋白條帶。離心收集重組體菌體，超聲波破碎離心，發(fā)現(xiàn)沉淀中含有目的蛋白，說(shuō)明目的蛋白以包含體的形式表達(dá)，沒(méi)有活性，需要復(fù)性才能分離純化。將兩個(gè)目的蛋白的包含體進(jìn)行酵母凝集實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)酵母凝集能力更強(qiáng)。說(shuō)明構(gòu)建大腸桿菌BL21(DE3