大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型的滑膜肽基精氨酸脫亞胺酶4(PADI4)及蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22(PTPN22)表達(dá)研究.pdf

1、目的：
　　探討肽基精氨酸脫亞胺酶4(PADI4)及蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22(PTPN22)在大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型的表達(dá)。
　　方法：
　　CIA模型建立將用0.1 mol/L冰醋酸溶解的CCⅡ與等體積的CFA充分乳化，配成終濃度為0.5g/L的乳劑。大鼠用水合氯醛（用量0.3mL/100g）麻醉后，模型組于大鼠背部及鼠尾根部多點(diǎn)皮下注射配制好的Ⅱ型膠原溶液，總量為1 mL。1周后上述方法、相同劑量再進(jìn)行1次。對

2、照組注射等體積的生理鹽水。
　　取材與包埋實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死大鼠，取左后足跖趾關(guān)節(jié)，10％多聚甲醛固定1周，脫鈣液（鹽酸加甲酸溶液）脫鈣，用大頭針檢測脫鈣滿意后，將關(guān)節(jié)常規(guī)脫水、包埋、切片;同時(shí)分離雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織，立即放入液氮中，隨后-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?br>　　觀察指標(biāo):一般情況觀察:觀察大鼠體毛的色澤、活動(dòng)狀態(tài)、排便及食量的變化情況并每周測定大鼠體重。(2)關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI):根據(jù)關(guān)節(jié)腫脹、顏色及關(guān)節(jié)活動(dòng)情況記錄并評價(jià)大鼠

3、全身關(guān)節(jié)病變程度，每7d評定1次，共評定6次。評分標(biāo)準(zhǔn):0分，無紅腫;1分，小趾關(guān)節(jié)稍腫;2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹;3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部足爪腫脹。四肢肢體的病變程度累積積分為AI，最高為16分。(3)足趾容積的測定:根據(jù)排水法原理，用自制的關(guān)節(jié)容積測量器測量大鼠左后足雙踝連線以下全足容積，每周測量1次，共測6次。
　　免疫組織化學(xué)染色:
　　跖趾關(guān)節(jié)標(biāo)本均用10％中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μ

4、m厚切片，采用SP染色，經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水，組織抗原熱修復(fù)。滴加一抗（1∶150的兔抗PADI4、1∶50的兔抗PTPN22）后4℃冰箱孵育過夜;滴加二抗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素，室溫孵育20 min。各步驟間以PBS沖洗5 min，連續(xù)3次。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。光鏡下觀察，胞膜或胞漿著棕黃或棕色者為陽性表達(dá)。計(jì)算染色后PADI4和PTPN22表達(dá)陽性細(xì)胞的數(shù)目。每個(gè)處理組做3張染片，每張染片隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)非重

5、疊視野(×400)下的陽性細(xì)胞數(shù)，數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖片采集設(shè)備:NIS-ElementsF3.0，分析軟件:Nikon NIS-Elements BR3.0。
　　Western blot檢測:
　　用不同時(shí)期CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜的做Western blot檢測。取保存于-80℃中的膝關(guān)節(jié)滑膜，加入適量裂解液裂解滑膜組織，超聲破碎儀破碎組織后取上清，采用

6、BCAProtein Assay Kit測蛋白濃度后，每個(gè)樣品均調(diào)整為40μg/μl的蛋白終濃度，每孔上樣20μl后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電壓強(qiáng)度為80V，電泳1h后，改為120V，電泳2h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，電轉(zhuǎn)移的條件設(shè)定為恒電壓100V，2h。然后將PVDF膜浸泡入5％的脫脂牛奶中2h，加入一抗后4℃孵育過夜(1∶1000的兔抗PADI4、1∶500的兔抗PTPN22，1∶15000鼠抗GAPDH)。復(fù)溫30min，TBS

7、T洗膜后加入二抗(1∶5000的辣根過氧化物酶驢抗兔/小鼠IgG)室溫下孵育2h，TBST洗膜后進(jìn)行ECL顯色反應(yīng)、曝光、顯影、過水、定影。
　　Real-time PCR檢測:
　　取保存于-80℃中的膝關(guān)節(jié)滑膜，加入1ml Trizol(Gibco BRL，Breda, TheNetherlands)冰上勻漿，離心使RNA充分溶解，測RNA濃度。根據(jù)所測濃度，逆轉(zhuǎn)錄cDNA:含1ugRNA反應(yīng)混合物置于42℃，60min

8、。用水稀釋引物至100ul，聚合酶鏈反應(yīng)PCR后，PCR循環(huán)，條件如下:94℃5min;94℃45s; Tm+4℃45s;72℃45s229-34（從第2步開始循環(huán)30-35個(gè)循環(huán)）;72℃7min;4℃12h。PCR結(jié)束后置于冰上開始電泳。保存圖像。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢測的數(shù)據(jù)輸入SPSS19.0分析軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用-x±s表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性意義。
　　結(jié)果：