重組精氨酸脫亞胺酶的異源表達(dá)、純化及性質(zhì)研究.pdf

1、精氨酸脫亞胺酶(Argininedeiminase，EC3.5.3.6)簡稱ADI，廣泛存在于細(xì)菌、古細(xì)菌、厭氧真核生物中，是ADI途徑精氨酸降解的第一個(gè)酶，在精氨酸缺陷型腫瘤、白血病治療等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，但目前用于臨床試驗(yàn)的重組ADI主要來源于支原體，生物安全方面存在著一定的隱患，所以開發(fā)一種既具有高活性，又沒有生物安全隱患的ADI具有非常重要的意義。 本研究通過PCR技術(shù)獲得了變形假單胞菌(Pseudomonaspl

2、ecoglossicidaCGMCC2039)ADI基因序列，并對其進(jìn)行了序列測定和分析。測序結(jié)果顯示，基因開放閱讀框?yàn)?254bp，編碼417個(gè)氨基酸，推測蛋白質(zhì)大小為46.5kDa。Blast分析顯示它與惡臭假單胞菌(P.putida)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)同源性分別高達(dá)97％和85％。 將獲得的ADI基因片段克隆到pMD18—T載體上，酶切后與表達(dá)載體pET28a進(jìn)行連接，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28a

3、—ADI，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。SDS-PAGE與WesternBlot分析證明重組ADI基因獲得了表達(dá)，酶活測定證明其具有一定活性。通過初步誘導(dǎo)條件優(yōu)化，確定了誘導(dǎo)劑IPTG最適濃度0.4mM，誘導(dǎo)時(shí)間4h，誘導(dǎo)溫度30℃，并通過超聲波破碎，SDS-PAGE分析證實(shí)了包涵體的存在。 利用鎳瓊脂糖凝膠親和層析實(shí)現(xiàn)了重組ADI的一步純化，SDS-PAGE分析顯示純化蛋白分子量大小約為49kDa，與推測大小相符，純化蛋白比酶活