精氨酸脫亞胺酶的分泌型表達(dá)研究.pdf

1、精氨酸脫亞胺酶(ADI：EC3.4.3.6)是一種精氨酸降解酶,催化精氨酸生成瓜氨酸。ADI廣泛存在于細(xì)菌、古細(xì)菌、厭氧真核生物中,它是一種治療精氨酸缺陷型腫瘤(如肝細(xì)胞癌、黑素瘤)的藥物。本研究室前期從環(huán)境中篩選獲得一株ADI高產(chǎn)菌株,經(jīng)鑒定為Pseudomonas plecoglossicida CGMCC2039。前期研究將該變形假單胞菌來源的ADI在大腸桿菌BL21中進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá),存在包涵體多、純化分離步驟較繁瑣等缺陷。為簡化分

2、離純化并提高該酶作為人類抗癌藥的應(yīng)用潛力,本論文將變性假單胞菌來源的ADI在畢赤酵母和大腸桿菌中分別進(jìn)行分泌型表達(dá)。
　　 將來源于變形假單胞菌的精氨酸脫亞胺酶(ADI)編碼基因arcA根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化,然后將優(yōu)化后的基因yh-ADI克隆至表達(dá)載體pPIC9K。成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pVIC9K-yh-ADI。畢赤酵母轉(zhuǎn)化子經(jīng)96孔板傳代培養(yǎng)后,再進(jìn)行G418篩選獲得多拷貝重組子。對酵母重組子誘導(dǎo)條件的初步優(yōu)化,

3、得到酵母重組子在1％甲醇誘導(dǎo)72 h后ADI活性最高,GS115/pPIC9K-yh-ADI酶活29.0 mU/mL。
　　 同時為了獲得高表達(dá)的ADI,還研究了ADI在大腸桿菌中的分泌表達(dá)。將變形假單胞菌的精氨酸脫亞胺酶(ADI)編碼基因克隆至具有阿拉伯糖啟動子的分泌型表達(dá)載體pBAD/gⅢ B中,經(jīng)鑒定得到重組質(zhì)粒pBAD-ADI。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F'后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),分別考察了誘導(dǎo)物L(fēng)-arabinose濃度

4、、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時間對重組蛋白表達(dá)的影響,確定最適誘導(dǎo)條件為L-arabinose濃度0.002％(w/v),25℃下誘導(dǎo)5 h,全細(xì)胞的酶活為68 mU/mL。采用Osmotic Shock法使ADI從胞周質(zhì)釋放出來,經(jīng)檢測分泌到胞周質(zhì)的重組蛋白活性為53 mU/mL,細(xì)胞內(nèi)的酶活為34 mU/mL。SDS-PAGE分析顯示,重組蛋白大小約為46 kDa,與理論結(jié)果一致。
　　 通過ADI在大腸桿菌及畢赤酵母中的分泌表達(dá),得到