甲狀旁腺素羧基端肽段的表達(dá)及其對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文甲狀旁腺素羧基端肽段的表達(dá)及其對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響姓名：李敬華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：郭剛20100501天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文進(jìn)行濃度為15％的SDSPAGE，觀察多肽表達(dá)情況；表達(dá)產(chǎn)物電泳凝膠對(duì)硝酸纖維素濾膜恒壓轉(zhuǎn)膜，山羊抗人PTH羧基端多克隆抗體進(jìn)行WesternBlot鑒定，Xray曝光觀察顯影情況。5表達(dá)多肽的分離純化與濃度測(cè)定大量表達(dá)產(chǎn)物的碎菌上清進(jìn)行Ni2_IDA

2、金屬螯合親和層析，收集洗脫液，BCA法測(cè)定純化后總蛋白濃度，采用ChemiGenius凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的多肽的純度，計(jì)算多肽濃度。6PTH各種多肽片段對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響復(fù)蘇凍存的大鼠成骨細(xì)胞，傳代并接種于96孔板，待培養(yǎng)至細(xì)胞處于亞融合狀態(tài)后分別加入不同濃度rhPTHl臥rhPTHl34、rhPTH784及rhPTH3784。作用24小時(shí)，MTT法檢測(cè)570nm吸光度值，觀察細(xì)胞增殖情況。結(jié)果1PCR擴(kuò)增結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)15

3、％瓊脂糖凝膠電泳，獲得了約270bp、250bp及160bp的清晰條帶，與預(yù)期一致。2重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pQE一30XafPTHl84、pQE一30Xa／PTH784及pQE30XaJPTH3784經(jīng)PCR初步鑒定，瓊脂糖凝膠可見(jiàn)相應(yīng)大dxDNA片段；經(jīng)Sall和腳玎dIII雙酶切，得到約3500bp的pQE30Xa線性片段和約270bp、250bp及160bp含目的基因的重組片段；酶切陽(yáng)性質(zhì)粒DNA測(cè)序分析與預(yù)

4、期完全一致。3表達(dá)產(chǎn)物的SDS—PAGE及WesternBlot鑒定誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE鑒定，考馬斯亮藍(lán)R250染色可見(jiàn)碎菌上清液中存在分子量與預(yù)期大小相符的蛋白條帶；以抗人PTH羧基端多克隆抗體進(jìn)行鑒定，顯示有明顯的蛋白質(zhì)印跡帶，證實(shí)條帶為含有PTH羧基端肽段的多肽。4表達(dá)產(chǎn)物BCA濃度測(cè)定及純度鑒定IPTG優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)后，產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析法純化，BCA法蛋白濃度測(cè)定及凝膠成像分析后計(jì)算rhPTHl84、rhPTH784