心葉煙RNA依賴的RNA聚合酶6(NgRDR6)基因的分離及功能分析.pdf

1、早在上個世紀(jì)七十年代，人們就在中國的卷心菜中發(fā)現(xiàn)了可以催化植物RNA病毒復(fù)制的物質(zhì)，并命名為RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp），起初認(rèn)為行使這一功能的是植物RDR。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)，行使這一催化功能的是病毒自身的RdRp，而非植物的。這一重大發(fā)現(xiàn)使得植物RDR成為新的研究熱點(diǎn)。到目前為止，已在多種植物中分離得到了RDRs基因，擬南芥、煙草、番茄、豇豆、黃瓜、水稻等。植

2、物RDRs是一個復(fù)雜的家族，現(xiàn)已在擬南芥中分離了六個同源基因。本文以心葉煙（Nicotiana glutinosa）為實(shí)驗(yàn)材料，首次從心葉煙中克隆得到RDR基因（NgRDR6），并對其進(jìn)行了序列比對，表達(dá)特性分析及初步功能鑒定，為進(jìn)一步研究該基因的功能及作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、利用RT-PCR和RACE-PCR得方法，首次從心葉煙中克隆得到了一個RDR基因，命名為NgRDR6。該基因GenBank注冊號

3、為FJ490363。序列分析結(jié)果表明，NgRDR6 cDNA全長為3，921 bp，包括3，594 bp的開放閱讀框（ORF），123 bp的5’非編碼區(qū)（5’UTR）和204 bp的3’非編碼區(qū)（3’UTR）。該基因編碼一個1，197個氨基酸殘基的多肽，預(yù)測分子量為135.472 kDa。通過同源性比較發(fā)現(xiàn)，心葉煙RDR6與其它植物RDR6的同源性很高，如與水稻RDR6的同源性達(dá)57.92％，而與擬南芥RDR6的同源性更高達(dá)65.00

4、％。NgRDR6含有RDRs家族所有的保守區(qū)。進(jìn)化分析表明NgRDR6與植物RDR6聚集成簇，而與其它RDRs的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。NgRDR6基因組全長5，696 bp，包含兩個內(nèi)含子，內(nèi)含子大小分別為1，140 bp和644 bp。其中，內(nèi)含子1位于5’UTR內(nèi)，推測該內(nèi)含子可能具有特殊的功能。
　　 2、利用半定量PCR的方法，研究了NgRDR6在多種生物和非生物因素誘導(dǎo)下mRNA水平的表達(dá)情況。研究表明，NgRDR6可以在非生

5、物因素ABA、GA和MeJA處理的情況下高水平表達(dá)，且在接種真菌煙草立枯病菌和煙草炭疽病菌及CMV后，NgRDR6 mRNA水平持續(xù)高水平表達(dá)達(dá)數(shù)天。而在PVY，TMV，H2O2和SA處理的情況下，NgRDR6 mRNA水平的表達(dá)量無明顯變化。對克隆得到的啟動子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了多個響應(yīng)植物激素的特殊作用元件，如響應(yīng)GA和MeJA的元件，而且還找到了響應(yīng)外界脅迫的元件。這些元件的存在，也許可以解釋NgRDR6在多種非生物因素處理下的表

6、達(dá)情況。
　　 3、將NgRDR6 cDNA全長連入pB1121載體，構(gòu)建得到了NgRDR6正義表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化本生煙（Nicotiana benthamiana），同時轉(zhuǎn)空載體為對照。經(jīng)卡那霉素篩選獲得若干再生植株。經(jīng)過PCR鑒定及半定量RT-PCR分析，結(jié)果證明NgRDR6在轉(zhuǎn)基因煙草中得到成功表達(dá)。
　　 4、將鑒定好的T0轉(zhuǎn)基因植株選取兩個株系進(jìn)行自交繁育得到T1代。對T1進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)兩