森林腦炎病毒prM-E蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其免疫原性研究.pdf

1、森林腦炎又稱蜱傳腦炎，是由森林腦炎病毒經(jīng)硬蜱媒介所致自然疫源性急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病，主要分布于亞洲和歐洲一些國(guó)家。我國(guó)主要見于東北及西北原始森林地區(qū)。近年來隨著旅游事業(yè)的發(fā)展、外來人群的涌入、森林工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的改變和林區(qū)生態(tài)環(huán)境的破壞，使得森林腦炎流行范圍逐漸擴(kuò)大，病例數(shù)逐年上升。因此森林腦炎的防治受到高度重視。 中和試驗(yàn)(NT)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)是診斷黃病毒感染的最特異方法，然而中和試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，常需要幾天，且需要專門進(jìn)

2、行活病毒操作的封閉實(shí)驗(yàn)室，因此應(yīng)用受到一定限制?，F(xiàn)在一般使用ELISA試驗(yàn)檢測(cè)血清和CSF中特異性IgM和IgG抗體。商品化ELISA試劑盒使用滅活的病毒作為抗原，此種病毒的培養(yǎng)和抗原的純化需要在生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，存在許多安全隱患，并且發(fā)現(xiàn)完整滅活病毒作為抗原的ELISA試驗(yàn)與其他黃病毒感染有交叉反應(yīng)，因此許多學(xué)者針對(duì)替代抗原進(jìn)行了研究。 M和E蛋白是森林腦炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，E蛋白能誘導(dǎo)保護(hù)性抗體，具有與受體結(jié)合、細(xì)胞膜融合的

3、功能和血凝活性。prM-E基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，可牢固地錨定在胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，并保證prM與E間的共價(jià)結(jié)合。 本研究選擇我國(guó)森林腦炎病毒MDJ01株的prM-E基因作為靶基因，首先對(duì)其進(jìn)行了克隆表達(dá)。從TBE病毒MDJ01株感染的BHK21細(xì)胞培養(yǎng)液中提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增獲得含prM-E基因的DNA，利用NotⅠ和HindⅢ雙酶切后，將prM-E基因插入供體質(zhì)粒pFastBac1中，測(cè)序證實(shí)編碼基

4、因插入正確。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有BacmidDNA和Help質(zhì)粒的DH10Bac菌株，利用Tn7轉(zhuǎn)座子為工具，使之發(fā)生同源轉(zhuǎn)座，通過藍(lán)白斑篩選和PCR擴(kuò)增，獲得含有prM-E基因的重組BacmidDNA。 將重組BacmidDNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9后獲得重組桿狀病毒(rvBACME)，將rvBACME感染Sf9細(xì)胞，用RT-PCR對(duì)其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明prM-E基因在Sf9細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了相應(yīng)的mRNA。為了進(jìn)一步了解

5、rvBACME在昆蟲細(xì)胞中是否有蛋白表達(dá)，我們通過Western-blot對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行分析。結(jié)果表明，約在55kD位置存在與兔抗TBE病毒血清多抗特異結(jié)合的蛋白條帶，而且與預(yù)期的分子量一致，表明prM-E片段在昆蟲細(xì)胞中有表達(dá)，并且有良好的抗原性。從感染的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清中，用電鏡觀察到重組蛋白顆粒，即類病毒顆粒(viruslikeparticle，VLP)。這些VLPs的直徑在30nm左右，分泌至細(xì)胞外。用間接免疫熒光試驗(yàn)對(duì)表

6、達(dá)產(chǎn)物的抗原性進(jìn)行了進(jìn)一步分析，結(jié)果表明，重組prM-E蛋白與抗TBE全病毒免疫血清及單抗間有良好的特異反應(yīng)性，提示該重組蛋白具有良好的抗原性，對(duì)于TBE感染有一定的診斷意義。 在獲得重組蛋白的基礎(chǔ)上，建立了檢測(cè)森林腦炎患者血清的ELISA方法。在該ELISA方法中，以感染細(xì)胞上清作為抗原，抗森林腦炎病毒單抗為捕捉抗體。16份經(jīng)間接免疫熒光法證明是陽性的血清，使用重組抗原的IgG-ELISA檢測(cè)時(shí)，16份均為陽性；間接免疫熒光法

7、檢測(cè)結(jié)果為陰性的6份血清，用重組蛋白IgG-ELISA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)依然是陰性，證明重組表達(dá)抗原ELISA具有高度特異性和靈敏度，可用于森林腦炎病毒抗體檢測(cè)。 同時(shí)還建立了重組病毒抗原間接免疫熒光檢測(cè)森林腦炎病毒抗體的方法。用重組病毒感染的Sf9細(xì)胞制備成病毒感染抗原片，用于間接免疫熒光法檢測(cè)森林腦炎病毒抗體，抗原片的胞漿顯出黃綠色免疫熒光，本底低，干擾小，結(jié)果容易判斷，陰性樣本呈現(xiàn)橘紅色，沒有特異熒光，與TBE病毒感染的BHK21

8、細(xì)胞抗原片呈現(xiàn)的反應(yīng)特性一致。以重組抗原片進(jìn)行IFA檢測(cè)，16份TBE患者血清均為陽性，6份正常人血清均為陰性。這一結(jié)果與重組抗原ELISA和原病毒抗原片間接免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果一致，說明感染細(xì)胞抗原也可以用于IgG抗體的檢測(cè)。 本研究采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了含TBE病毒MDJ01株prM-E嵌合基因的重組桿狀病毒載體，并在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)出具有免疫原性的森林腦炎病毒蛋白，然后利用此蛋白，初步建立了ELISA