穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒prM-E蛋白細(xì)胞系的構(gòu)建.pdf

1、西尼羅病毒(West Nile Virus，WNV)屬黃病毒科，黃病毒屬，是一種重要的人獸共患傳染病病毒。多種鳥類和哺乳動(dòng)物對(duì)該病毒易感，其中馬受WNV的危害最為嚴(yán)重。人感染該病毒后可導(dǎo)致西尼羅熱，嚴(yán)重者出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，甚至可致死亡。該病毒對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康都構(gòu)成了巨大威脅。WNV尚無(wú)特異性的治療方法，疫苗免疫接種是控制該病的主要措施。
　　目前國(guó)外已經(jīng)報(bào)道了幾種獸用WNV疫苗，我國(guó)尚且沒有可用的WNV疫苗。傳統(tǒng)減毒活疫苗和

2、滅活疫苗免疫原性比較好，但仍存在缺陷，如滅活苗免產(chǎn)生疫應(yīng)答較慢，只能誘導(dǎo)低水平體液免疫，弱毒疫苗具有有潛在性安全問題等，因此研究者們致力于研發(fā)更為安全有效的新型疫苗。
　　研究表明WNV prM-E蛋白能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，并自我組裝成病毒樣顆粒(VLPs)。該病毒樣顆粒與天然的病毒顆粒在誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答方面有著相似的能力。本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中已經(jīng)利用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了流行性乙型腦炎病毒(JEV)病毒樣顆粒。因此，本

3、實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建一個(gè)能夠持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)WNV VLPs的真核細(xì)胞系，為后續(xù)制備WNV亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　為鑒定細(xì)胞系表達(dá)目的蛋白情況，本實(shí)驗(yàn)制備并篩選了一株WNV prM蛋白特異性單克隆抗體。該單抗細(xì)胞上清和腹水ELISA效價(jià)分別為1∶2048和1∶409600以上;單抗亞型鑒定結(jié)果表明10F7屬于IgG2a，其輕鏈類型為κ鏈;Western blot和IPMA結(jié)果顯示，該單抗與WNV prM特異性反應(yīng)，與JEV無(wú)交叉反應(yīng)。

4、　　將編碼WNV prM蛋白和E蛋白基因的重組質(zhì)粒pCAG-opti-WNV-prME轉(zhuǎn)染進(jìn)BHK-21細(xì)胞，然后用含有G418的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)多次亞克隆并結(jié)合間接免疫熒光(IFA)和抗原捕獲ELISA方法篩選，最終得到一個(gè)能夠穩(wěn)定表達(dá)WNV prM-E蛋白的細(xì)胞系W-92。IFA和流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明該細(xì)胞系持續(xù)到第30代仍然保持高水平的蛋白表達(dá)。對(duì)W-92細(xì)胞系表達(dá)產(chǎn)物分離純化后電鏡觀察，結(jié)果表明prM蛋白可與E蛋白組裝成病

5、毒樣顆粒。將該病毒樣顆?？乖庖咝∈蠛螅蓹z測(cè)到較高效價(jià)的ELISA抗體;誘導(dǎo)的抗體具有病毒中和作用，對(duì)WNV的中和抗體效價(jià)為1∶40，對(duì)JEV的中和效價(jià)介于1∶20～1∶80，有一定程度的交叉保護(hù)作用。將純化后的VLPs免疫鵝后，其血清的JEV中和效價(jià)介:1∶20～1∶40之間。在使用JEV病毒P3株對(duì)小鼠致死性病毒攻擊試驗(yàn)中，免疫小鼠保護(hù)率為50％-70％。
　　本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一株能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)WNV prM-E蛋白的真核細(xì)胞系