西尼羅河病毒結(jié)構(gòu)蛋白prM+E在大腸桿菌及昆蟲細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、西尼河病毒（West Nile Virus，WNV）屬于單鏈正股RNA病毒其中的黃病毒科黃病毒屬，可引起人類及馬、鳥類等多種動(dòng)物發(fā)病。WNV有三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：C（Capsid）蛋白、E（Envelope）蛋白和M（Membbranc）蛋白。研究表明，在一定條件下同時(shí)表達(dá)E蛋白和M蛋白的前體prM可以形成病毒樣顆粒（VLP）。
　　 試驗(yàn)第一部分以西尼羅河病毒NY99株的序列為基礎(chǔ)，通過分段合成得到prM和E蛋白的全基因。通過PCR

2、擴(kuò)增在prm+e基因兩側(cè)引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)及純化標(biāo)簽，然后將其插入到供體質(zhì)粒pFast-Bac1中得到重組質(zhì)粒Pfast-Bacl-W。將測序驗(yàn)證無誤的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH10-Bae。在DH10-Bac中，目的基因借助轉(zhuǎn)座子的協(xié)助插入到桿粒中，并破壞空桿粒原有的半乳糖苷酶基因。試驗(yàn)中通過藍(lán)白斑篩選及PCR驗(yàn)證得到重組桿粒。將提取純化的重組桿粒轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾sf9細(xì)胞，得到重組桿狀病毒。以重組桿狀病毒感染正常的sf9細(xì)胞，然后收

3、集感染不同時(shí)間段的細(xì)胞及上層培養(yǎng)基，通過RT-PCR、SDS-PAGE和Western Blot檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。
　　 將重組質(zhì)粒Pfast-Bac1-W轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH10-Bac，篩選得到的白斑經(jīng)多對引物擴(kuò)增都與預(yù)期的一致，說明重組桿粒構(gòu)建成功。用重組桿粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后得到的一代病毒重新感染細(xì)胞可以看到明顯的細(xì)胞病變。經(jīng)檢測二代病毒液病毒粒子的滴度為7.6×107pfu/ mL。將二代病毒液以感染復(fù)數(shù)（MO

4、I）等于5的比例感染正常的sf9細(xì)胞，反轉(zhuǎn)錄PCR顯示在感染后的第一天目的基因就得到了轉(zhuǎn)錄，同時(shí)有少量的重組桿狀病毒釋放到培養(yǎng)基中。SDS-PAGE顯示在43.0-66.0kD之間，感染細(xì)胞裂解液較正常細(xì)胞的裂解液多出一條帶。經(jīng)Western Blot檢測，這一差異蛋白能與WNV兔多抗反應(yīng)，從分子量上判斷，該蛋白為WNV的E蛋白。
　　 本研究的第二部分通過T載體過渡將prm+e基因插入到兩個(gè)原核表達(dá)載體pET-30a（+）、p

5、GEX-4T-1中得到重組質(zhì)粒pET-30-W，pGEX-4T-1-W。經(jīng)測序驗(yàn)證正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，以IPTG誘導(dǎo)。取不同時(shí)間和不同IPTG濃度下誘導(dǎo)的樣品以SDS-PAGE和Western Blot檢測目的蛋白以確認(rèn)目的蛋白是否表達(dá)及最佳的誘導(dǎo)條件。
　　 試驗(yàn)結(jié)果顯示，prM+E蛋白無法在大腸桿菌BL21中得到表達(dá)，嘗試不同時(shí)間誘導(dǎo)和不同濃度的IPTG誘導(dǎo)也沒有改善。
　　 試驗(yàn)一是國內(nèi)外首次使

6、用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出完整的prM+E蛋白，雖然通過Western Blot沒有檢測到prM/M蛋白，但是由于prm/m基因的讀框與e基因一致且位于前端，一旦E蛋白表達(dá)，prM/M蛋白必然已經(jīng)得到表達(dá)。prM+E蛋白的存在形式及是否得到分泌還需要進(jìn)一步研究。通過裂解細(xì)胞純化的E蛋白不僅可以作為檢測抗原，還可以用作亞單位疫苗。如果能進(jìn)一步驗(yàn)證培養(yǎng)基中存在VLP形式的蛋白，則經(jīng)過濃縮即可以用于MAC-ELISA等檢測方法，因此該試驗(yàn)為