新生鼠MCMV感染早期Toll樣受體及Th1-Th2類細(xì)胞因子水平的研究.pdf

1、目的：通過檢測新生鼠鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus MCMV)感染前后脾淋巴細(xì)胞Toll樣受體(Toll-like receptors)2、9和髓樣分化因子(Myeloidcell differentiation MyD88)表達(dá)量及脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Th1/Th2類細(xì)胞因子表達(dá)水平，探討新生鼠MCMV感染早期天然免疫應(yīng)答的啟動及逃避免疫監(jiān)視的可能機制，并尋求針對巨細(xì)胞病毒感染特異性免疫治療的新途徑。

2、r>　　方法：1.建立新生鼠全身播散型感染模型:MCMV經(jīng)3T3細(xì)胞增殖后，在不使用免疫抑制劑條件下，新生小鼠腹腔接種MCMV懸液，建立MCMV全身播散型感染新生鼠模型。
　　2.實驗分組:將64只新生鼠隨機分為兩組，MCMV模型組（32只）和正常對照組(32只)，模型組按建模方法建立模型，對照組腹腔注射等量生理鹽水，于模型后第3、5、7、10d取兩組新生鼠各組織樣本（每時間點各8只），無菌分離脾臟，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，提取細(xì)胞蛋

3、白，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
　　3.實時熒光定量PCR法檢測MCMV模型組各組織中MCMV-DNA含量。
　　4.蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)檢測兩組脾淋巴細(xì)胞TLR2、TLR9及MyD88表達(dá)水平。
　　5.夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測兩組脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平。
　　6.采用經(jīng)典相關(guān)分析(Pearson相關(guān)分析)，分析④與⑤之間的相關(guān)性。
　　結(jié)

4、果：1.模型組重要臟器（心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺）MCMV-DNA-PCR后瓊脂糖凝膠電泳100bp處可見陽性條帶，而對照組則沒有陽性表達(dá);模型組在不同時間點實時熒光定量PCR可見不同程度MCMV-DNA擴增。
　　2.TLR2、TLR9、MyD88蛋白在模型組第3d時表達(dá)與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為2.02，-0.74和0.00，P均＞0.05）;第5d時蛋白表達(dá)開始增加，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為4

5、3.58，17.32和20.52，P均＜0.01）;第7d達(dá)高峰，與同組第5d比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，（t分別為5.30，10.96和13.07，P均＜0.01）;與同組第10d比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，（t分別為4.06，4.45和14.20，P均＜0.05），第10d時開始下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為13.97，10.14和21.37，P均＜0.01）。
　　3.模型組小鼠中，脾淋巴細(xì)胞上清液中IL-2表達(dá)

6、水平第3d開始下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-1.53，P＜0.05），第7d時降至最低水平，與同組前、后時間點比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為-10.76，-3.84，P均＜0.05）;IFN-γ表達(dá)水平第3d開始升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.30，P＜0.01），第5d時迅速達(dá)高峰，與同組前、后兩時間點比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為14.66，15.90，P均＜0.01），后逐漸下降至基線水平，與對

7、照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.18，P＞0.05）;IL-10第5d時開始升高，呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t分別為9.60，5.83和16.37，P均＜0.05)。
　　4.TLR2、TLR9、MyD88蛋白濃度與IL-2含量成負(fù)相關(guān)（r=-0.978，r=-0.960，r=-0.979，P均＜0.001）;與IFN-γ的含量無線性相關(guān)(r=0.126，r=0.170，r=0.333，P均＞0.0

8、5);與IL-10含量成正相關(guān)（r=0.954，r=0.914，r=0.892，P均＜0.001）。
　　結(jié)論：1.在不使用免疫抑制劑條件下，通過腹腔接種MCMV懸液可建立新生鼠MCMV全身播散型感染模型，為巨細(xì)胞病毒感染治療藥物篩選、療效評價、疾病發(fā)病機制及疾病預(yù)后評估提供良好的研究平臺。
　　2.MCMV感染早期（感染7d前），可刺激機體天然免疫應(yīng)答，上調(diào)TLRs表達(dá)，進(jìn)一步活化獲得性免疫應(yīng)答，通過MyD88依賴途徑刺激