落新婦抗腫瘤活性成分對腫瘤細胞免疫抑制的逆轉(zhuǎn)作用研究.pdf

1、免疫逃逸(immune escape)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要的作用，其機制復雜，涉及腫瘤和宿主兩方面。從腫瘤角度來說，一方面，腫瘤抗原的缺失、MHC分子的改變、共刺激分子的缺乏等都可以使腫瘤免受宿主免疫細胞的識別，從而逃脫抗腫瘤免疫反應(yīng);另一方面，腫瘤也可以通過“Fas反擊機制”、免疫抑制性分子的分泌等機制主動影響抗腫瘤免疫細胞的增殖活化和功能。3β-羥基齊墩果-12-烯-27-羧酸(3β-hydroxyolean-12-en

2、-27-oic acid，ATA)、3β,6β-二羥基齊墩果-12-烯-27-羧酸(3β,6β-dihydroxyolean-12-en-27-oic acid，ATB)和3β-羥基烏蘇-12-烯-27-羧酸(3β-hydroxyur-12-en-27-oic acid，ATC)系虎耳草科Saxifragaceae植物落新婦Astilbechinese(Maxim.)Franch.et Say.的干燥根莖中分離得到的抗腫瘤活性三萜化合物

3、，能顯著抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡，同時具有增強機體免疫功能的作用，而其在腫瘤免疫逃逸機制方面的研究尚未見報道。本研究選擇具有免疫抑制作用的人紅白血病K562細胞和小鼠成纖維瘤L929細胞，通過檢測3個化合物處理前后腫瘤細胞對免疫功能的影響及其免疫抑制分子mRNA表達的變化，從逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制的角度探討這些化合物的抗腫瘤免疫作用機制。
　　 1.K562和L929細胞的免疫抑制作用研究
　　 MTT法測定K562

4、和L929細胞不同培養(yǎng)時間的培養(yǎng)上清對小鼠脾細胞增殖反應(yīng)和自然殺傷(NK)細胞殺傷活性的影響。結(jié)果表明: K562和L929細胞培養(yǎng)不同時間的培養(yǎng)上清對Con A和LPS誘導的小鼠脾細胞增殖反應(yīng)，以及NK細胞殺傷活性均呈抑制作用，且隨著培養(yǎng)時間的延長，抑制率逐漸升高，證實K562和L929細胞培養(yǎng)上清具有免疫抑制作用。
　　 2.ATA、ATB和ATC對K562和L929腫瘤細胞免疫抑制作用的影響
　　 MTT法檢測AT

5、A、ATB和ATC處理K562和L929腫瘤細胞再培養(yǎng)上清對小鼠脾細胞增殖反應(yīng)和NK細胞殺傷活性影響。結(jié)果顯示:ATA、ATB和ATC處理K562和L929細胞再培養(yǎng)上清對Con A和LPS誘導的脾細胞增殖反應(yīng)以及NK細胞殺傷活性的抑制作用均顯著低于單純K562和L929細胞培養(yǎng)上清，說明ATA、ATB和ATC可逆轉(zhuǎn)K562和L929細胞對小鼠脾細胞增殖反應(yīng)和NK殺傷活性的抑制作用。
　　 3.ATA、ATB和ATC對K562和

6、L929細胞TGF-β1和VEGF基因表達的影響
　　 K562和L929細胞經(jīng)ATA、ATB和ATC作用48小時后，其轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)和血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)mRNA表達水平均顯著低于未處理的對照細胞。表明ATA、ATB、ATC能下調(diào)K562和L929細胞TGF-β1和VEGF

7、mRNA表達。
　　 4.ATA、ATB和ATC處理K562和L929細胞對小鼠脾細胞分泌細胞因子的影響
　　 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定ATA、ATB和ATC處理K562和L929細胞再培養(yǎng)上清對小鼠脾細胞分泌白細胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ干擾(Interferon-γ，IFN-γ)能力的影響。結(jié)果顯

8、示:小鼠脾細胞與K562和L929細胞培養(yǎng)上清共孵育48h后，其上清中TNF-a和IFN-γ含量顯著降低，而IL-4水平顯著提高，說明K562和L929細胞能抑制Th1型細胞因子產(chǎn)生，促進Th2型細胞因子分泌。K562和L929細胞經(jīng)ATA、ATB和ATC處理后，其再培養(yǎng)上清對小鼠脾細胞分泌TNF-a和IFN-γ的抑制作用，以及對IL-4產(chǎn)生的促進作用均較單純K562和L929培養(yǎng)上清降低。說明ATA、ATB和ATC均能逆轉(zhuǎn)K562和L

9、929細胞促進小鼠脾細胞分泌Th2型細胞因子，以及抑制分泌Th1型細胞因子的作用。
　　 5.ATA、ATB和ATC處理K562和L929細胞對小鼠脾細胞細胞因子基因表達的影響
　　 采用RT-PCR方法檢測經(jīng)3種化合物作用后的K562和L929細胞再培養(yǎng)上清對小鼠脾細胞細胞因子基因表達的影響。結(jié)果表明:與單純腫瘤培養(yǎng)上清對照比較，ATA、ATB和ATC處理K562和L929細胞再培養(yǎng)上清均能促進小鼠脾細胞IFN-γ、T

10、NF-α和IL-2 mRNA表達，ATB和ATC處理K562和L929細胞再培養(yǎng)上清則能顯著抑制小鼠脾細胞IL-10 mRNA表達。同時，ATA處理L929細胞再培養(yǎng)上清刺激的小鼠脾細胞IL-10 mRNA表達水平也顯著低于單純L929培養(yǎng)上清，而ATA處理K562腫瘤細胞再培養(yǎng)上清共孵育小鼠脾細胞IL-10 mRNA表達水平則顯著高亍單純K562培養(yǎng)上清。說明ATA、ATB和ATC均能拮抗K562和L929細胞對小鼠脾細胞Th1型細胞