黃芪總黃酮及其活性成分對腫瘤細(xì)胞的抑制作用與機(jī)理研究.pdf

1、一、研究背景
　　 肝癌是世界發(fā)病率最高的五大癌癥之一，每年有上百萬人死于肝癌，世界范圍內(nèi)每年的新發(fā)病例數(shù)約為550000，占人類癌癥的5％，是死亡率僅次于胃癌、食管癌的第三大常見惡性腫瘤，我國每年死于肝癌約11萬人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％。目前對肝癌的主要治療方法是進(jìn)行手術(shù)治療（切除或抑制），但大多數(shù)肝癌病人發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期，并不符合手術(shù)治療條件，并且手術(shù)治療后面臨術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的問題。
　　 白血病是嚴(yán)重危害人類

2、生命健康的造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，K562細(xì)胞株是一株惡化程度較高的人類慢性髓源性白血病細(xì)胞系，在體外具有分化為紅細(xì)胞和多種髓細(xì)胞的多能性.迄今白血病的治療仍主要采用傳統(tǒng)的大劑量聯(lián)合化療，但此療法副作用大，復(fù)發(fā)率高，而且對正常機(jī)體免疫與造血系統(tǒng)有極大的損害。研究惡性腫瘤尤其是白血病細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)機(jī)制已成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)最熱點(diǎn)的前沿課題之一，從祖國醫(yī)學(xué)寶庫中尋找抑制白血病惡性增殖已成為治療白血病的希望和重要途徑。
　　 黃芪是一味歷史

3、悠久、臨床應(yīng)用十分廣泛的中藥，具有保護(hù)心腦血管、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、降低肝損傷、抗氧化、抗突變和治療糖尿病等作用。研究還發(fā)現(xiàn)，該類化合物在癌癥的預(yù)防和治療方面具有較強(qiáng)的活性。近年來，關(guān)于黃芪提取物及其主要成分的免疫調(diào)節(jié)作用和心血管保護(hù)作用的研究已取得很大進(jìn)展。黃芪總黃酮是從黃芪中分離的抗氧化清除自由基的主要活性成分，經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所鑒定，黃芪總黃酮中主要含有6種單體化合物，其中4種為異黃酮類化合物，它們分別是：β-谷甾醇、芒

4、柄花素、毛蕊異黃酮、β-谷甾醇-3.0-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。本課題選用實(shí)體瘤的細(xì)胞株BEL-7402和血液病細(xì)胞株K562，研究黃芪總黃酮及其單體化合物對肝癌細(xì)胞、紅白血病細(xì)胞生長的抑制作用并探討了其部分相關(guān)機(jī)制。
　　 二、研究內(nèi)容和目的
　　 1.體外觀察黃芪總黃酮及其單體化合物抑制肝癌細(xì)胞株BEL-7402、紅白血病細(xì)胞株K562生長的

5、作用，明確量效關(guān)系，選擇藥物的半數(shù)抑制濃度為后期機(jī)制研究作參考。
　　 2.明確黃芪總黃酮及其單體化合物對BEL-7402細(xì)胞周期的影響，進(jìn)一步研究藥物對細(xì)胞周期相關(guān)基因的改變情況；同時(shí)研究黃芪總黃酮及其單體化合物對BEL-7402細(xì)胞蛋白組的影響。
　　 3.明確黃芪總黃酮及其單體化合物對K562細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的影響，并確定藥物對K562細(xì)胞內(nèi)cyclin D1 mRNA的影響。
　　 4.為臨床應(yīng)用黃芪治療肝癌

6、、紅白血病提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 三、研究方法
　　 1.應(yīng)用MTT法測定不同濃度（20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml）的黃芪總黃酮及其單體化合物作用不同時(shí)間（24h、48h、72h）對紅白血病細(xì)胞株K562的生長抑制作用；中性紅方法測定不同濃度（1μg/ml、3.16μg/ml、10μg/ml、31.6μg/ml、100μg/ml和316μg/ml）的黃芪總黃酮及其單體化合物對人肝癌

7、細(xì)胞株BEL-7402的生長抑制作用。
　　 2.流式細(xì)胞儀（FCM）采用PI染色檢測不同濃度的黃芪總黃酮及其單體化合物對肝癌細(xì)胞株BEL-7402、紅白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞周期分布的影響。
　　 3.采用Annexin V/PI凋亡試劑盒通過FCM分析檢測黃芪總黃酮及其單體化合物誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的情況，選擇半數(shù)抑制濃度作用不同時(shí)間（2h、4h、6h、12h和24h），觀察是否具有濃度以及時(shí)間依賴性。
　　

8、 4.基于對細(xì)胞周期阻滯的確定性判斷，采用基因芯片方法檢測黃芪總黃酮及其單體化合物對BEL-7402細(xì)胞周期相關(guān)基因的改變。
　　 5.應(yīng)用雙向凝膠電泳、MALDI-TOF-MS生物質(zhì)譜技術(shù)研究黃芪總黃酮及其單體化合物對BEL-7402細(xì)胞蛋白組的影響。
　　 6.RT-PCR技術(shù)檢測黃芪總黃酮及其單體化合物毛蕊異黃酮對K562細(xì)胞內(nèi)cyclin D1 mRNA水平的影響。
　　 四、研究結(jié)果
　　 1.

9、0TT結(jié)果顯示，黃芪總黃酮及毛蕊異黃酮對K562細(xì)胞的生長抑制作用呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性，其24h、48h和72h的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為98.63μg/ml、87.90μg/ml、63.10μg/ml和130.32μg/ml、123.03μg/ml、122.18μg/ml；中性紅結(jié)果顯示，黃芪總黃酮、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對BEL-7402細(xì)胞作

10、用48h后的IC50分別為40μg/ml、69.93μg/ml、100μg/ml、100μg/ml和100μg/ml。
　　 2.黃芪總黃酮及其單體化合物作用于K562、BEL-7402細(xì)胞，在一定濃度范圍內(nèi)隨濃度增加，G0/G1期比例明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少；用半數(shù)抑制濃度劑量的黃芪總黃酮及毛蕊異黃酮并不能明顯誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡。
　　 3.細(xì)胞周期基因芯片檢測顯示黃芪總黃酮及其活性成分作用BEL-7402細(xì)胞4

11、8h后，與對照組比較，黃芪總黃酮、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷組差異表達(dá)基因分別為45、17、6、4和25條。
　　 4.蛋白質(zhì)組技術(shù)顯示與對照組相比，黃芪總黃酮組表達(dá)上調(diào)的蛋白有11種，表達(dá)下調(diào)的蛋白有1種，質(zhì)譜鑒定出10個(gè)差異蛋白；毛蕊異黃酮作用于BEL-7402細(xì)胞，表達(dá)上調(diào)的蛋白有14種，表達(dá)下調(diào)的蛋白有2種，質(zhì)譜鑒定出14個(gè)差異蛋白；毛蕊異黃酮-

12、7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷作用于BEL-7402細(xì)胞，表達(dá)上調(diào)的蛋白有6種，表達(dá)下調(diào)的蛋白有7種，質(zhì)譜鑒定出10個(gè)差異蛋白；芒柄花素作用于BEL-7402細(xì)胞，表達(dá)上調(diào)的蛋白有8種，表達(dá)下調(diào)的蛋白有4種，質(zhì)譜鑒定出9個(gè)差異蛋白；芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷作用于BEL-7402細(xì)胞，表達(dá)上調(diào)的蛋白有10種，表達(dá)下調(diào)的蛋白有5種，質(zhì)譜鑒定出12個(gè)差異蛋白。
　　 5.RT-PCR技術(shù)檢測顯示IC50劑量的黃芪總黃酮及毛

13、蕊異黃酮對K562細(xì)胞作用24h后，cyclin D1 mRNA水平開始下降。
　　 五、研究結(jié)論
　　 1.黃芪總黃酮及其單體化合物能夠抑制K562細(xì)胞、BEL-7402細(xì)胞的生長，且抑制作用呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性。
　　 2.黃芪總黃酮能夠阻滯BEL-7402細(xì)胞周期在G0/G1期，可能與上調(diào)CDKN3、CDKN1B、CDKN2B、CDKN2C和RB1，下調(diào)CDK5、Skp2、E2F1，CCNF和CCND3

14、的表達(dá)相關(guān)；毛蕊異黃酮能夠阻滯BEL-7402細(xì)胞周期在G0/G1期，可能與上調(diào)RBX1、CDC2，下調(diào)CKS1、CCNA2、Skp2、E2F2、CCND3、CCNC的表達(dá)相關(guān)；毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷將BEL-7402細(xì)胞周期組滯在G0/G1期，可能與下調(diào)CCNA2、CDK2、CCNB1有關(guān)；芒柄花素能夠?qū)⒓?xì)胞阻滯在GdG1期，可能與上調(diào)GADD45A、CKS2、Skp1A有關(guān)；芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷能

15、夠?qū)⒓?xì)胞阻滯在G0/G1期，可能與上調(diào)CDC2、GADD45A、CKS2、CDKN1B、Skp1A、RBX1，下調(diào)Skp2、CCNF、CCND3有關(guān)。
　　 3.蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定技術(shù)顯示黃芪總黃酮能改變BEL.7402細(xì)胞中10種蛋白質(zhì)的表達(dá)，毛蕊異黃酮能改變BEL.7402細(xì)胞中14種蛋白質(zhì)的表達(dá)，毛蕊異黃酮-7-O-β-D一吡喃葡萄糖苷能改變BEL.7402細(xì)胞中10種蛋白質(zhì)的表達(dá)，芒柄花素能改變BEL.7402細(xì)胞中9種蛋白

16、質(zhì)的表達(dá)，芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷能改變BEL-7402細(xì)胞中12種蛋白質(zhì)的表達(dá)，其中與腫瘤發(fā)生的相關(guān)蛋白有轉(zhuǎn)膠蛋白2、磷酸化應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白1、抗氧化蛋白1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29、磷酸甘油酸變位酶1、膽綠素還原酶B、硫氧還原蛋白過氧化物酶等，這些蛋白表達(dá)的改變可能與黃芪總黃酮及其單體化合物的抗腫瘤機(jī)制有關(guān)。
　　 4.黃芪總黃酮及毛蕊異黃酮能夠下調(diào)K562細(xì)胞內(nèi)cyclin D1的mRNA水平，阻止細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物的磷酸