鴨疫里默氏桿菌微生物學(xué)特性研究及檢測方法的建立.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）是一種主要侵害雛鴨，火雞等鳥類的革蘭氏陰性致病菌，2～7周齡鴨最易被其感染而導(dǎo)致鴨傳染性漿膜炎。世界現(xiàn)已報道21個血清型RA，分別以阿拉伯?dāng)?shù)字1～21命名，各型之間缺乏交叉保護，這也給鴨傳染性漿膜炎的預(yù)防造成困難。
　　 試驗一對已保存或分離的不同血清型RA的培養(yǎng)特性、鏡檢形態(tài)、生化反應(yīng)、藥敏試驗等進行了研究。通過對不同pH值液體培養(yǎng)基中RA生長情況的摸索，

2、確定其最適生長pH值;配制此pH值的TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)RA，每隔2h活菌計數(shù)一次，將結(jié)果繪制成該菌的一步生長曲線。革蘭氏陰性菌的外膜蛋白(OMP)往往具有較好的反應(yīng)原性，試驗一采用低溫超速離心法提取了2型RA的OMP，通過SDS-PAGE電泳確定了其主要的蛋白電泳條帶;根據(jù)2型RA OMP和鴨抗2型RA血清的玻片凝集及瓊脂擴散試驗，證明了RA的OMP具有反應(yīng)原性。試驗一最后通過RA人工感染鴨試驗，對RA的致病性、患病鴨的臨床癥狀及病死鴨的

3、內(nèi)臟病變等進行了研究。
　　 試驗二根據(jù)RA16S rRNA基因的保守序列設(shè)計一對特異性引物，通過對引物濃度、Taq DNA聚合酶濃度、退火溫度、模板提取方式等條件的摸索，建立了RA的臨床PCR診斷方法。試驗二同時研究了此PCR方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性。試驗結(jié)果表明:其敏感性較高，25μL的檢測體系對菌落的最低檢出量為30～300CFU，對DNA模板的最低檢出量為0.025～0.25ng;特異性較好，4株不同的RA檢測結(jié)果均

4、為陽性，鴨大腸桿菌、鴨巴氏桿菌、鴨沙門氏菌的檢測結(jié)果均為陰性;穩(wěn)定性較強，同一樣品連續(xù)8天的重復(fù)試驗均呈陽性。最后，利用已建立的PCR診斷方法，對不同鴨場的共20羽疑似鴨傳染性漿膜炎病例進行了診斷，結(jié)果為12羽鴨的RA檢測呈陽性。
　　 試驗三根據(jù)RA16S rRNA基因的保守序列設(shè)計一對特異性引物和一個Taqman探針（探針5'末端由FAM標(biāo)記、3'末端由TAMRA標(biāo)記），通過構(gòu)建陽性克隆標(biāo)準(zhǔn)品、優(yōu)化引物濃度、Taqman探針

5、濃度，建立了RA的熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測方法，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其線性回歸方程。試驗三同時研究了此FQ-PCR診斷方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，并將其敏感性與普通PCR做了比較。結(jié)果表明，F(xiàn)Q-PCR的敏感性極高，20μL的檢測體系最低檢出量為1.03個DNA模板，敏感性約是普通PCR的100倍;特異性較好，5株不同的RA檢測結(jié)果均為陽性，鴨大腸桿菌、鴨巴氏桿菌、鴨沙門氏菌的檢測結(jié)果則均為陰性;穩(wěn)定性較強，通過單次平行試

6、驗和多次重復(fù)試驗及其結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析，此方法的批內(nèi)變異系數(shù)（intra-assay CV％）僅為0.49％～0.73％;批間變異系數(shù)(inter-assay CV％)僅為0.91％～1.15％。
　　 試驗三應(yīng)用已建立的FQ-PCR檢測方法分別對RA自然和人工感染鴨病例的不同臟器的細(xì)菌進行定量檢測，確定了陰陽性臨界Ct值，并對臨床疑似陽性病例進行診斷。結(jié)果表明，自然和人工感染鴨病例不同臟器的RA含量有所不同，其分別在前者的大腦、