環(huán)氧二十碳三烯酸在非酒精性脂肪性肝炎中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種常見(jiàn)的肝臟疾病，尤其在發(fā)達(dá)國(guó)家具有較高的患病率。其定義為無(wú)過(guò)量飲酒史(或酒精攝入量<20g/d)，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性和脂質(zhì)蓄積為特征的臨床病理綜合征。該病的整個(gè)病理過(guò)程包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化等四個(gè)階段。非酒精性脂肪肝患者中約有20％～30％可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其與單純脂肪變性的區(qū)別主要在于肝細(xì)胞氣球樣變和炎癥損傷的存在

2、，并可能最終進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌。目前有關(guān)非酒精性脂肪性肝炎形成的確切機(jī)制尚未完全明確，而普遍認(rèn)可的是經(jīng)典的“二次打擊”學(xué)說(shuō)。所謂的“第一次打擊”是指外周和肝臟的胰島素抵抗所導(dǎo)致的脂質(zhì),尤其是脂肪酸和甘油三酯在肝細(xì)胞中的蓄積,即脂肪變性。而“第二次打擊”則是由氧化應(yīng)激，脂質(zhì)過(guò)氧化和大量的炎性因子（如TNF-α，IL-1和IL-6）等多種因素導(dǎo)致的炎癥損傷。而其中TNF-α被認(rèn)為是單純性脂肪肝進(jìn)展為脂肪性肝炎的主要細(xì)胞因子,可以通過(guò)1）

3、與肝細(xì)胞膜上受體結(jié)合，活化Casepase-8，進(jìn)而活化Casepase-3，直接導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡；2）抑制線粒體的呼吸功能并增加線粒體活性氧物質(zhì)和過(guò)氧化脂質(zhì)的形成，導(dǎo)致肝細(xì)胞膜的破壞和引起炎癥反應(yīng)。3）活化其他炎性細(xì)胞因子如IL-6、IL-8和某些粘附分子，形成放大炎癥效應(yīng)，誘發(fā)肝臟炎癥。
　　研究表明，巨噬細(xì)胞在非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NASH模型中，肝臟枯否細(xì)胞大量活化，并且產(chǎn)生多種促炎因子

4、以及ROS，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。經(jīng)膽堿蛋氨酸缺乏（MCD）飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH模型中，肝臟內(nèi)TNFα及MCP-1的mRNA表達(dá)水平明顯增加,而后者是巨噬細(xì)胞活性的強(qiáng)效介質(zhì)。NASH發(fā)病過(guò)程中巨噬細(xì)胞參與肝損傷的機(jī)制，一方面在于無(wú)法正確的識(shí)別及消除危險(xiǎn)因素，另一方面又由于細(xì)胞毒性機(jī)制的過(guò)度動(dòng)員，使得無(wú)法阻止炎癥反應(yīng)。另外，巨噬細(xì)胞暴露于游離脂肪酸后，也可通過(guò)與相應(yīng)細(xì)胞表面受體及胞內(nèi)信號(hào)的相互作用影響炎癥反應(yīng).
　　環(huán)氧二十碳三烯酸（E

5、ET）是花生四烯酸（AA）第三條代謝通路中通過(guò)細(xì)胞色素P450表氧化酶催化底物花生四烯酸反應(yīng)生成的代謝產(chǎn)物之一，是具有強(qiáng)大生物學(xué)活性的內(nèi)生性脂質(zhì)環(huán)氧化物。該表氧化酶途徑可產(chǎn)生四種同分異構(gòu)體，即5,6-EET，8,9-EET，11,12-EET和14,15-EET。但EETs在體內(nèi)半衰期很短，由可溶性環(huán)氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolyse，sEH）迅速降解為活性較低的二羥基-二十碳三烯酸（dihydroxyei

6、cosatrienoic acids，DHETs），因此在體內(nèi)很難研究這些脂環(huán)氧化物。而可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑（soluble epoxide hydrolyse inhibitor，sEHI）可降低EETs的水解，提高體內(nèi)EETs的水平。
　　目前已發(fā)現(xiàn)EETs具有多種生理功能，如擴(kuò)張血管，降低血壓，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和胰島素抵抗等。有多項(xiàng)研究通過(guò)應(yīng)用sEH抑制劑，降低體內(nèi)EETs的水解，顯著降低了動(dòng)物模型體內(nèi)不同器官的炎癥反應(yīng)，

7、從而證實(shí)了EET在不同疾病中均具有抗炎作用。Node等人發(fā)現(xiàn)在利用TNF-a,IL-1及LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，EETs可通過(guò)抑制粘附分子（CAMs）的誘導(dǎo)而發(fā)揮抗炎作用。EETs還可通過(guò)抑制單核細(xì)胞合成前列腺素2緩解大鼠模型因注射LPS引起的發(fā)熱。但EETs在非酒精性脂肪性肝炎中的作用及其機(jī)制還沒(méi)有被證明。
　　本研究試圖探討EETs在MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪性肝炎中的保護(hù)性作用及其相關(guān)機(jī)制。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　一、建立

8、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠模型，并用sEH抑制劑TPPU進(jìn)行干預(yù)。
　　1.檢測(cè)小鼠肝臟內(nèi)EETs含量的變化；觀察體重、肝重及肝指數(shù)的變化；檢測(cè)肝功能(ALT/AST)，肝臟及外周血脂含量(TC/TG)；觀察小鼠肝組織病理變化及肝細(xì)胞脂肪變性程度；研究EETs在NASH的發(fā)生發(fā)展中對(duì)肝臟脂肪變性以及炎性損傷所起到的干預(yù)作用。
　　2.檢測(cè)外周血及肝臟內(nèi)炎性因子（TNF-α、IL-1、IL-6）和趨化因子（MCP-1/

9、CCL2、IL-8/CXCL8）水平的變化；檢測(cè)肝臟內(nèi)PPARα、ICAM-1、VCAM-1等炎性相關(guān)分子mRNA表達(dá)情況，及肝內(nèi)NF-kB的表達(dá)和活化情況，探討EETs在NASH病程中發(fā)揮干預(yù)作用的可能機(jī)制。
　　二、體外建立肝細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系，通過(guò)游離脂肪酸刺激及EETs直接干預(yù)后，檢測(cè)細(xì)胞上清炎性因子及趨化因子水平的變化，觀察細(xì)胞形態(tài)及胞內(nèi)脂滴大小等變化，探討EETs是否通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞的促炎作用，在NASH病程中發(fā)

10、揮保護(hù)效應(yīng)。
　　三、觀察MCD組、MCS組及MCD+TPPU組小鼠肝臟組織中NF-κB總的表達(dá)情況。獲取小鼠原代巨噬細(xì)胞，體外應(yīng)用游離脂肪酸刺激及EETs干預(yù)后，檢測(cè)巨噬細(xì)胞NF-κB入核活化的情況，探討EETs通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞炎性作用在NASH病程中發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)的具體機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.通過(guò)喂食C57BL/6小鼠蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飲食6周，建立非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠模型，干預(yù)組中則將s

11、EH抑制劑TPPU加入飼水中喂食小鼠。收集1w、2w、4w、5w、6w后模型組、干預(yù)組及對(duì)照組小鼠血清及肝組織標(biāo)本。自動(dòng)生化儀檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)肝功能(ALT/AST)，肝臟及外周血脂含量(TC/TG)；ELISA技術(shù)檢測(cè)肝臟內(nèi)EETs含量的變化,外周血及肝臟炎性因子（TNF-α、IL-1、IL-6）和趨化因子（MCP-1、IL-8）的表達(dá)水平。應(yīng)用HE染色觀察小鼠肝臟組織病理?yè)p傷情況,油紅染色觀察肝細(xì)胞脂肪變性程度。Realtime-PCR

12、方法測(cè)定肝臟內(nèi)PPARα、ICAM-1、VCAM-1等炎性相關(guān)分子mRNA表達(dá)情況。免疫組化技術(shù)檢測(cè)MCD飲食組、MCS飲食組及MCD+TPPU干預(yù)組小鼠肝臟組織中NF-κB的表達(dá)活化情況。
　　2.應(yīng)用Transwell小室，體外建立HepG2細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)體系，通過(guò)游離脂肪酸(油酸及棕櫚酸)刺激及4種EET同分異構(gòu)體分別干預(yù)后, ELISA檢測(cè)刺激組、干預(yù)組及空白對(duì)照組細(xì)胞上清炎性因子及趨化因子水平的變化;油紅染色

13、觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)及胞內(nèi)脂滴大小變化。
　　3.應(yīng)用石蠟油腹腔注射，3天后收集小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，游離脂肪酸刺激下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞12小時(shí)，干預(yù)組分別加入四種EET同分異構(gòu)體(5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET,14,15-EET)進(jìn)行干預(yù)后，激光免疫共聚焦觀察細(xì)胞內(nèi) NF-κB活化情況；提取巨噬細(xì)胞核蛋白，試劑盒檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.MCD飲食喂養(yǎng)6周后，小鼠的

14、體重和肝重均明顯下降，肝臟內(nèi)出現(xiàn)大量的脂肪沉積、肝細(xì)胞氣球樣變性及點(diǎn)狀壞死，伴有炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。同時(shí)，肝功能（ALT，AST）明顯升高，血漿內(nèi)甘油三酯和膽固醇水平下降，而肝內(nèi)甘油三酯水平顯著升高。經(jīng)TPPU干預(yù)后，小鼠肝臟內(nèi) EETs的含量顯著增加，肝細(xì)胞損傷和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的情況得到明顯改善，肝功能及肝內(nèi)甘油三酯水平顯著降低，但對(duì)血脂水平和肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積的無(wú)顯著影響。
　　2.MCD飲食誘導(dǎo)后，肝臟及血清內(nèi)促炎細(xì)胞因子（TNF-

15、α，IL-1，IL-6）以及相關(guān)
　　3.趨化因子（IL-8，MCP-1）水平均有所升高，尤其是TNF-α，IL-1和MCP-1。而在TPPU干預(yù)組小鼠中，這些指標(biāo)在不同時(shí)間點(diǎn)均有所下降。TPPU的干預(yù)還導(dǎo)致了炎癥相關(guān)粘附分子（ICAM-1，VCAM-1）mRNA表達(dá)水平的下調(diào)，而與脂類(lèi)代謝和抗炎密切相關(guān)的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-）的mRNA表達(dá)較 NASH組小鼠則有所升高。MCD組較MCS組小鼠肝臟組織中NF-κB

16、的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而TPPU干預(yù)組小鼠肝臟組織中NF-κB的表達(dá)較MCD組明顯減弱。
　　4.為了進(jìn)一步探討EETs是否能夠減少游離脂肪酸（FFA）刺激所誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的釋放及肝細(xì)胞損害，在體外將EETs的四種同分異構(gòu)體5,6–EET，8,9–EET，11,12-EET和14,15-EET–EET分別加入FFA刺激下的3種細(xì)胞體系中：1）HepG2細(xì)胞2）THP-1細(xì)胞3）HepG2和THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)體系。經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)

17、后，發(fā)現(xiàn)在HepG2和THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)體系中11,12-EET能顯著降低FFA刺激引起的TNF-α，MCP-1和IL-1β的釋放。5,6-EET和8,9-EET也可一定程度抑制TNF-α和IL-1β的釋放，但效果較弱，而14,15-EET幾乎沒(méi)有抑制作用。在游離脂肪酸的刺激下THP-1單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，11,12-EET也對(duì)TNF-α和IL-1的釋放具有抑制效果，但并沒(méi)有在HepG2和THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的作用顯著。而在HepG2單

18、獨(dú)培養(yǎng)時(shí)并未觀察到類(lèi)似現(xiàn)象。
　　4.小鼠原代巨噬細(xì)胞在FFA刺激下培養(yǎng)，并分別加入四種EET同分異構(gòu)體干預(yù)12小時(shí)后，激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA刺激后NF-κB入核明顯增加，而11,12-EET的干預(yù)可抑制該現(xiàn)象。
　　結(jié)論:
　　1.EETs的水解抑制劑（TPPU）可增加小鼠體內(nèi)EETs的含量，從而改善由MCD飲食誘導(dǎo)的脂肪性肝炎小鼠模型肝臟內(nèi)炎癥損傷、肝功能，降低肝內(nèi)甘油三酯水平,但對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性沒(méi)有明顯的影響

19、。
　　2.TPPU干預(yù)可顯著降低MCD飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型肝臟及血清內(nèi)促炎細(xì)胞因子以及相關(guān)趨化因子的水平；還導(dǎo)致了炎癥相關(guān)粘附分子表達(dá)水平的下調(diào)，而同時(shí)上調(diào)了促進(jìn)脂類(lèi)代謝的分子PPAR-的表達(dá)。
　　3.在體外HepG2和THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)體系中11,12- EET能顯著降低FFA刺激誘導(dǎo)下THP-1細(xì)胞分泌的相關(guān)促炎因子，5,6-EET和8,9-EET有類(lèi)似作用，但效果較弱，而14,15- EET的抑制作用最弱。