小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為前腦背側(cè)神經(jīng)元的體外研究.pdf

1、背景及目的：
　　 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES細(xì)胞)是囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在體外建立的穩(wěn)定的細(xì)胞系。ES細(xì)胞具有干細(xì)胞的全能性，重新移植入發(fā)育中的囊胚能夠形成嵌合體小鼠，也能在體外誘導(dǎo)分化成機(jī)體多種類型的細(xì)胞，是臨床退行性病變和組織損傷的潛在替代材料。
　　 哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)發(fā)育起始于外胚層神經(jīng)上皮的誘導(dǎo)分化，形成神經(jīng)板。隨后神經(jīng)上

2、皮快速擴(kuò)增，神經(jīng)板折疊并融合形成神經(jīng)管。其中，神經(jīng)管前端膨大區(qū)形成腦，后段發(fā)育為脊髓。在神經(jīng)管前部的預(yù)定腦區(qū)，神經(jīng)管局部膨大，形成結(jié)構(gòu)上區(qū)分明確的前腦(forebrain)、中腦(midbrain)和后腦(hindbrain)。前腦逐漸發(fā)育并分化為端腦(telencephalon)和間腦(diencephalon)；而端腦進(jìn)一步區(qū)分為背側(cè)和腹側(cè)；背側(cè)端腦最終形成大腦皮層和海馬(以及嗅腦)。大腦皮層是一切高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的中心，而海馬是記憶存

3、儲(chǔ)的主要區(qū)域，它們均來源于端腦(或者模糊稱為“前腦”)背側(cè)神經(jīng)元神經(jīng)前體細(xì)胞。小鼠大腦皮層的發(fā)育起始于胚胎第10天(E10)，增生的前體細(xì)胞位于腦室?guī)?ventricularzone，VZ)和室下帶(sub-ventricularzone，SVZ)，而新生的神經(jīng)元?jiǎng)t離開增殖區(qū)，沿輻輳方向向表層遷移。出生時(shí)，大腦皮質(zhì)由6層細(xì)胞組成，它們按照由內(nèi)向外的順序依次生成，即先生成的神經(jīng)元位于皮質(zhì)底層，而后生成的神經(jīng)元位于皮質(zhì)表層。
　　

4、大體上，體外ES細(xì)胞向神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化方案可歸為兩大類：(1)貼壁生長(zhǎng)的單層胚胎干細(xì)胞；(2)懸浮生長(zhǎng)的胚胎干細(xì)胞團(tuán)。前者主要依賴培養(yǎng)基和培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)因子的調(diào)控；后者除了培養(yǎng)基的因素，還包括細(xì)胞間的相互影響。Lee等誘導(dǎo)ES細(xì)胞形成類胚體(embryoid body，EB)，包含三個(gè)胚層起源的多種細(xì)胞類型。在這種混合細(xì)胞團(tuán)中，神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NS cell)能夠在含F(xiàn)GF2和EGF的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中得到擴(kuò)

5、增；并且擴(kuò)增的NS細(xì)胞經(jīng)Shh和FGF8b因子處理后，誘導(dǎo)產(chǎn)生包括多巴胺能神經(jīng)元在內(nèi)的多種中、后腦神經(jīng)元類型。
　　 控制前腦分化的信號(hào)主要有Wnt，BMP，F(xiàn)GF和Shh通路等。其中Wnt信號(hào)分子對(duì)于皮質(zhì)神經(jīng)元的產(chǎn)生和類型分化具有重要影響。在胚胎發(fā)育早期，Wnt分子沿神經(jīng)管從前到后濃度逐漸增加的梯度分布，誘導(dǎo)大腦中、后部神經(jīng)元特征。而發(fā)育相對(duì)晚期，雞胚的Wnt基因富集在預(yù)定的前腦背側(cè)或者其鄰近區(qū)域，參與前腦背側(cè)神經(jīng)元的發(fā)生和發(fā)

6、育，當(dāng)Wnt信號(hào)受到阻斷時(shí)，背側(cè)神經(jīng)元標(biāo)志Emxl，Pax6和Ngn2不能表達(dá)；而Wnt通路激活時(shí)，作用范圍內(nèi)的神經(jīng)元失去其腹側(cè)特征，而轉(zhuǎn)化為背側(cè)神經(jīng)元。小鼠胚胎研究中，經(jīng)典Wnt通路受到阻斷時(shí)也得到與之一致的結(jié)論。
　　 特異性基因標(biāo)志是研究體內(nèi)外細(xì)胞分化的重要工具。例如，轉(zhuǎn)錄因子Sox2基因上游一段5.7 kb的序列包含一個(gè)增強(qiáng)子，能夠驅(qū)動(dòng)Sox2基因的表達(dá)；在該增強(qiáng)子下游添加一段(beta)-geo序列，可觀察到該增強(qiáng)子激

7、活的Sox2表達(dá)最早出現(xiàn)于胚胎發(fā)育的第3.5天(embryo3.5，E3.5)，至E12.5天表達(dá)范圍局限于腦室?guī)?ventricularzone，VZ)等包含大量神經(jīng)干細(xì)胞的區(qū)域[5]。另一項(xiàng)研究采用Cre/loxP重組系統(tǒng)，將cre基因定點(diǎn)連接在FoxG1基因簇，并通過FoxG1-cre與3個(gè)不同的loxP報(bào)告基因的小鼠的雜交，得到基因重組小鼠，顯示正常的胚胎發(fā)育中，F(xiàn)oxG1分布于端腦、視泡、嗅上皮、中后腦交界等部位。最近一項(xiàng)研究

8、使用cre和Emx1基因重組，顯示Emx1基因表達(dá)在E9.5天開始出現(xiàn)，最早位于前腦背側(cè)，并在發(fā)育后期分布于海馬CA1-CA3區(qū)，以及齒狀核[7]。另外，一種神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性中間絲蛋白nestin的增強(qiáng)子，與lacZ報(bào)告基因融合，顯示nestin在神經(jīng)板和隨后的神經(jīng)管上增生細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 然而，這些報(bào)道中熒光蛋白尚不能代表神經(jīng)系統(tǒng)的皮層發(fā)育階段，即前腦背側(cè)神經(jīng)元的分化及增殖情況。胚胎發(fā)育12.5-15.5天對(duì)前腦背側(cè)神

9、經(jīng)元特異性標(biāo)記的D6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，提供了皮質(zhì)發(fā)育的理想模型。Stefan Krauss實(shí)驗(yàn)室建立的D6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶綠色熒光蛋白(green flurescentprotein，GFP)基因，該報(bào)告基因接受背側(cè)前腦特異性表達(dá)的Dach1基因增強(qiáng)子D6的調(diào)控。從小鼠胚胎10.5天起，前腦區(qū)域出現(xiàn)散在的GFP+細(xì)胞，逐漸分布于整個(gè)背側(cè)前腦，并持續(xù)至出生后。組織學(xué)染色證實(shí)D6-GFP+細(xì)胞主要為新皮層及海馬的神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元

10、。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的(1)體外擴(kuò)增培養(yǎng)D6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的胚胎干細(xì)胞；(2)探索誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化的方法，觀察前腦背側(cè)神經(jīng)元/神經(jīng)前體細(xì)胞的特定亞群在體外分化和增生情況；(3)探討Wnt信號(hào)通路對(duì)胚胎干細(xì)胞向前腦背側(cè)神經(jīng)元誘導(dǎo)的影響，以期優(yōu)化誘導(dǎo)方案。
　　 方法：
　　 1.不同細(xì)胞的體外培養(yǎng)：
　　 (1)D6-GFP小鼠胚胎干細(xì)胞在添加白細(xì)胞抑制因子1000 U/ml(leukemiainhibitor

11、y factor，LIF)的含10％胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)和傳代。
　　 (2)普通類胚體(normal embryoid body，nEB)在含5％基因敲除的血清替代物(KSR)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)；
　　 (3)快聚類胚體(quick embryoid body，qEB)在含5％基因敲除的血清替代物(KSR)的無血清培養(yǎng)基中，置于弧形底的96孔板培養(yǎng)。
　　 (4)流式分選的D6-GFP+細(xì)胞在含bFGF

12、10 ng/ml，和EGF20ng/ml，以及B271Unit/ml的神經(jīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)：分別制備不同的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)樣本，其中胚胎干細(xì)胞檢測(cè)使用細(xì)胞爬片，nEB為附著于多聚賴氨酸的細(xì)胞球，qEB為OCT冷凝劑包埋的-20℃制備的冰凍切片，分化的神經(jīng)球細(xì)胞爬片，進(jìn)行常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，包括固定，通透，抗原封閉，一抗孵育，二抗孵育和核染色等步驟。其中二抗使用熒光共軛抗體，反應(yīng)結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察

13、染色結(jié)果。
　　 3.定量PCR檢測(cè)：提取RNA，標(biāo)本來自(1)胚胎干細(xì)胞，分化6天的nEB，分化12天的nEB，以及培養(yǎng)的前腦神經(jīng)干細(xì)胞。(2)qEB細(xì)胞中顯微解剖得到的D6-GFP陽性和非陽性細(xì)胞。使用全RNA提取試劑盒提取RNA，使用寡核苷酸引物p(NT)6合成cDNA和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用SYBR綠色熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
　　 4.流式細(xì)胞檢測(cè)：選取不同代數(shù)的胚胎干細(xì)胞，使用胰酶/EDTA消化

14、和分散后，調(diào)節(jié)細(xì)胞終濃度為0.5×106/ml，在PBS中使用SSEA-1(IgM)單克隆抗體進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，加入Alexa594-熒光共軛二抗后，沖洗，使用FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行陽性細(xì)胞的定量檢測(cè)。
　　 5.流式細(xì)胞分選：取含有D6-GFP+細(xì)胞簇的快聚類胚體，使用胰酶/EDTA消化和分散后，使用FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣本檢測(cè)和分選。GFP信號(hào)的采集波長(zhǎng)范圍是488±5nm。分別收集D6-GFP陽

15、性和非陽性細(xì)胞。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有檢測(cè)重復(fù)2遍以上。定量檢測(cè)的指標(biāo)中，統(tǒng)計(jì)數(shù)值使用mean±S.E.M表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1.胚胎干細(xì)胞的體外擴(kuò)增
　　 1.1 D6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠ES細(xì)胞的形態(tài)學(xué)：D6-GFP小鼠ES細(xì)胞呈現(xiàn)單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密排列，邊界不明顯，而成片生長(zhǎng)的細(xì)胞周圍邊緣光滑。
　　 1.2 D6-GF

16、P小鼠ES細(xì)胞的增殖特點(diǎn)：小鼠ES細(xì)胞處于活躍的細(xì)胞分裂期，增殖迅速，平均約每1.5天擴(kuò)增8倍。
　　 1.3 D6-GFP小鼠ES細(xì)胞表達(dá)原始細(xì)胞標(biāo)志：ES細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)原始干細(xì)胞特征分子Oct4和Sox2，而分化細(xì)胞(神經(jīng)元/神經(jīng)前體細(xì)胞)的標(biāo)志則為陰性。
　　 2.胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化-普通類胚體
　　 2.1 普通類胚體(nEB)的形成：D6-GFP小鼠胚體干細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)為普通類胚體(normal emb

17、ryoid body，nEB)，nEB在1-2天內(nèi)形成，大小不等，呈現(xiàn)球形或橄欖形，培養(yǎng)早期類胚體表面光滑，細(xì)胞聚集緊密；后期在表面附著有少量壞死細(xì)胞或細(xì)胞碎片。
　　 2.2 普通類胚體(nEB)中分化細(xì)胞的基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化：比較胚胎干細(xì)胞，分化6d的nEB，分化12天的nEB，以及培養(yǎng)的前腦來源的神經(jīng)干細(xì)胞。結(jié)果顯示，(1)全能性干細(xì)胞的標(biāo)志Oct4，Nanog，和Klf4表達(dá)逐漸減弱，前腦神經(jīng)組織的特異性分子FoxG1，

18、Pax6，Sox5，和Dach1等分子表達(dá)上調(diào)。(2)同時(shí)，Nkx2.1，Hoxb9和GFAP等非前腦組織特異分子，和Brachyury(Bra)和Vimentin等非神經(jīng)的組織特異分子的表達(dá)也有上調(diào)。(3)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的分子基因表達(dá)也有變化.
　　 2.3 nEB細(xì)胞分化為神經(jīng)元/神經(jīng)前體細(xì)胞：對(duì)完整的附著于玻璃蓋玻片表面的nEB，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示nEB細(xì)胞，表達(dá)神經(jīng)相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)志nestin，Tujl和G

19、FAP。然而，在懸浮生長(zhǎng)的nEB內(nèi)，D6-GFP+細(xì)胞幾乎不可見；經(jīng)固定和免疫細(xì)胞化學(xué)染色強(qiáng)化后，少數(shù)EB顯示出GFP的表達(dá)。
　　 3.胚胎干細(xì)胞向前腦背側(cè)神經(jīng)元的分化-快聚類胚體
　　 3.1 動(dòng)態(tài)觀察快聚類胚體(qEB)的形成：懸浮的D6-GFP小鼠胚胎干細(xì)胞，在96孔培養(yǎng)板快速聚集(<24 hr)成快聚類胚體(quick embryoid body，qEB)。qEB形成迅速，細(xì)胞團(tuán)大小一致；在相同的分化時(shí)間，細(xì)胞

20、團(tuán)體積遠(yuǎn)大于普通類胚體(nEB)。qEB通常誘導(dǎo)ES細(xì)胞產(chǎn)生D6-GFP+細(xì)胞，D6-GFP+細(xì)胞出現(xiàn)在大約分化第10天，每個(gè)qEB細(xì)胞團(tuán)通常包含1-2個(gè)D6-GFP+細(xì)胞簇，D6-GFP+qEB的產(chǎn)生幾率約為40％(n=6)。使用不同因子處理，提示bFGF/EGF提高D6-GFP+qEB的幾率至75％(n+2)，但D6-GFP+細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比從35％減少至19.6％。同時(shí)，bFGF/EGF因子處理的D6-GFP+細(xì)胞的熒光相對(duì)

21、較暗。
　　 3.2 快聚類胚體(qEB)中分化細(xì)胞的分子標(biāo)志：qEB冰凍切片的免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示D6-GFP+細(xì)胞與前腦背側(cè)神經(jīng)元/神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志Sox2，Pax6，Tbr1和Tbr2等表達(dá)重合。D6-GFP+細(xì)胞簇內(nèi)細(xì)胞的單極表達(dá)N-cadherin分子。
　　 3.3 快聚類胚體(qEB)中D6-GFP陽性和非陽性細(xì)胞基因表達(dá)：基因表達(dá)檢測(cè)顯示前腦蛋白FoxG1和前腦背側(cè)神經(jīng)元標(biāo)志Dach1，Pax6和Sox5

22、在D6-GFP陽性細(xì)胞中的表達(dá)量多于非陽性細(xì)胞。
　　 3.4 Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞分化中的調(diào)控作用：qEB培養(yǎng)的后期用Wnt信號(hào)通路的激動(dòng)劑和抑制劑處理。未處理組D6-GFP+細(xì)胞比率為35％，Wnt3a分子處理后增加至57％，Dkk1處理后減少至18％。全反式維甲酸處理，無GFP+細(xì)胞產(chǎn)生。
　　 3.5 快聚類胚體(qEB)來源的D6-GFP+細(xì)胞具有神經(jīng)干細(xì)胞特性
　　 3.5.1 D6-GFP+細(xì)胞的增

23、殖：流式細(xì)胞分選從qEB中獲得純化的D6-GFP陽性和非陽性細(xì)胞，其中D6-GFP+細(xì)胞在7-10天后形成神經(jīng)球，球內(nèi)細(xì)胞保持明亮的綠色熒光。
　　 3.5.2 D6-GFP+細(xì)胞的分化：qEB來源的D6-GFP+細(xì)胞經(jīng)神經(jīng)球培養(yǎng)擴(kuò)增后，在神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基(不含EGF因子)中貼壁并分化為nestin+，Tuj1+和GFAP+細(xì)胞，三者百分比分別為87.7％，9.6％，和4.2％。
　　 結(jié)論：
　　 1. D

24、6-GFP小鼠的ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下，能夠快速擴(kuò)增，并維持其未分化的干細(xì)胞狀態(tài)。
　　 2. ES細(xì)胞經(jīng)普通類胚體(nEB)誘導(dǎo)，表達(dá)前腦背側(cè)神經(jīng)元/神經(jīng)前體細(xì)胞的分子標(biāo)志，但未能有效誘導(dǎo)D6-GFP+細(xì)胞。
　　 3. ES細(xì)胞經(jīng)快聚類胚體(qEB)誘導(dǎo)，有效誘導(dǎo)D6-GFP+細(xì)胞。利用GFP+標(biāo)記可以對(duì)前腦背側(cè)神經(jīng)元/神經(jīng)前體細(xì)胞的增生和分化進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，定量檢測(cè)，細(xì)胞分選和分子調(diào)控等實(shí)驗(yàn)。
　　 4：q