靶向HBV的高效siRNA的篩選及體內(nèi)、外抗病毒研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染是全世界最重要的公共衛(wèi)生問題之一，嚴(yán)重危害人類健康。盡管預(yù)防疫苗免疫降低了乙肝發(fā)生率，但目前全世界仍有約4億HBV感染者，當(dāng)前的藥物治療方法尚不足于應(yīng)對(duì)該挑戰(zhàn)，因此迫切需要發(fā)展新的更為有效的治療手段以對(duì)付HBV的威脅。RNAi是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)序列特異性抑制基因表達(dá)的機(jī)制，將RNAi技術(shù)應(yīng)用于包括病毒性肝炎等在內(nèi)的疾病治療己成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，而獲得兼具高效抑制特性和保守性特征的RNAi靶位是RNAi治療方法

2、獲得成功應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。本研究以生物信息學(xué)為輔助，通過建立多基因型HBV細(xì)胞和小動(dòng)物表達(dá)模型，對(duì)HBV基因組上潛在的siRNA靶點(diǎn)進(jìn)行了規(guī)?；Y選和驗(yàn)證，獲得多個(gè)具有良好應(yīng)用潛力的siRNA靶點(diǎn)，為進(jìn)一步應(yīng)用RNAi技術(shù)開發(fā)新型乙肝治療方法提供重要基礎(chǔ)。 本研究首先通過Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得623個(gè)已報(bào)道的HBV全基因組序列，應(yīng)用GCG生物信息學(xué)工作站對(duì)其進(jìn)行全基因組的序列保守性分析，獲得同源性為95％以上的高保守序列區(qū)段。采

3、用步移法設(shè)計(jì)可靶向上述高保守序列區(qū)段的siRNA，并通過RNAi脫靶效應(yīng)分析軟件進(jìn)行分析，初篩獲得40個(gè)可識(shí)別不同位點(diǎn)并具有高保守特征的候選siRNA靶點(diǎn)序列，并以pSUPER為載體分別構(gòu)建了相應(yīng)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，用于進(jìn)行進(jìn)一步的篩選實(shí)驗(yàn)。本研究采用與HBV1.3倍體克隆質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同siRNA對(duì)HBV的抑制效率。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的5個(gè)分屬Cl、Dl、Ae基因型的HBV1.3倍體克隆在Huh-7細(xì)胞中建立了體外HBV瞬時(shí)表

4、達(dá)模型，結(jié)果顯示其均可有效在Huh-7細(xì)胞中表達(dá)HBV重要標(biāo)志性抗原HBsAg與HBeAg。同時(shí)通過對(duì)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)與共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒用量配比的比較分析，確定了較有利于篩選高效靶點(diǎn)的檢測(cè)條件。在此基礎(chǔ)上，將本研究構(gòu)建的40個(gè)包含候選siRNA表達(dá)元件的質(zhì)粒克隆分別與上述HBV1.3倍體克隆以1：10的用量比例對(duì)Huh-7細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同靶點(diǎn)siRNA對(duì)HBV蛋白表達(dá)的抑制能力。結(jié)果顯示，本研究選擇設(shè)計(jì)的40個(gè)siRNA可在不同程度上抑

5、制HBV的表達(dá)，其中部分靶點(diǎn)的siRNA體現(xiàn)出良好的抑制效果(部分靶點(diǎn)已申請(qǐng)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枺?00810110686.4)。本研究選擇了其中3個(gè)抑制效率較好的siRNA靶點(diǎn)(B244、B245、B376)用于進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。通過CCK8檢測(cè)細(xì)胞毒性與細(xì)胞活力，和干擾素相關(guān)基因STAT-1及OSA-1表達(dá)水平檢測(cè)顯示上述3個(gè)靶點(diǎn)siRNA在細(xì)胞中的表達(dá)不會(huì)引起的細(xì)胞活性及干擾素相關(guān)基因基因轉(zhuǎn)錄水平的異常變化，顯示其無脫靶效應(yīng)。

6、 RNAi技術(shù)應(yīng)用于抗病毒治療研究中另一重要方面是如何有效地將siRNA或siRNA表達(dá)元件導(dǎo)入靶細(xì)胞中。應(yīng)用HBV表達(dá)細(xì)胞株HepG2—N10，本研究探討了通過重組慢病毒載體和化學(xué)修飾siRNA的方式導(dǎo)入siRNA抑制HBV表達(dá)的可行性。本研究分別構(gòu)建了可表達(dá)靶向B1579、B1881、B2391、B2393的siRNA的重組慢病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)HBV表達(dá)細(xì)胞株HepG2—N10后檢測(cè)結(jié)果顯示可顯著抑制HBV的表達(dá)。本研究同時(shí)合成了可靶向

7、B244、B376的siRNA，以及針對(duì)同樣靶點(diǎn)的分別經(jīng)5’端甲氧基修飾、磷酸化修飾和固醇修飾的siRNA，對(duì)HepG2—N10細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化學(xué)合成的siRNA均能有效下調(diào)HepG2—N10細(xì)胞HBV蛋白的表達(dá)，其中經(jīng)修飾后的siRNA可表現(xiàn)出更好的抑制效果。 為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究獲得的siRNA在動(dòng)物模型體內(nèi)對(duì)HBV表達(dá)的抑制效果，本研究應(yīng)用尾靜脈高壓注射法和不同基因型的HBV1.3倍體克隆建立了HBV小鼠模型。通過