DHBV衣殼蛋白表達(dá)純化、初步應(yīng)用及其編碼基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)時(shí)相的研究.pdf

1、1.DHBV PreC/C基因序列分析、克隆表達(dá)、蛋白純化及多抗制備
　　為了建立DHBV快捷準(zhǔn)確的檢測方法及深入探究鴨乙型肝炎病毒衣殼蛋白的功能，對(duì)DHBV CHv株P(guān)reC/C基因及其編碼蛋白的分子特性進(jìn)行了分析。PCR方法擴(kuò)增編碼衣殼蛋白的PreC/C基因，經(jīng)測序鑒定后構(gòu)建PreC/C基因的原核表達(dá)載體pET-32a(+)/PreC/C。利用大腸桿菌宿主表達(dá)菌Rosetta(DE3)對(duì)衣殼蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘

2、導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度進(jìn)行了優(yōu)化。利用重組衣殼蛋白的組氨酸標(biāo)簽，采用Ni離子親和層析柱對(duì)衣殼蛋白進(jìn)行純化。通過純化的衣殼蛋白免疫大白兔制備兔抗DHBV衣殼蛋白多克隆抗體。結(jié)果表明，PreC/C基因長789 bp，編碼262個(gè)氨基酸的衣殼蛋白。構(gòu)建有PreC/C基因原核表達(dá)載體pET-32a(+)/PreC/C在表達(dá)菌Rosetta(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，DHBV衣殼蛋白在誘導(dǎo)溫度37℃、IPTG濃度0.8mM、誘導(dǎo)時(shí)間6h的條件下其表達(dá)量

3、達(dá)到最高，占菌體總蛋白量的80％以上。利用Ni離子親和層析柱對(duì)帶有組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白進(jìn)行純化后得到條帶單一、濃度達(dá)2mg/mL的重組衣殼蛋白。通過純化的衣殼蛋白免疫動(dòng)物所得到的血清在瓊擴(kuò)試驗(yàn)中效價(jià)達(dá)到1∶32。
　　2.鴨乙型肝炎病毒衣殼蛋白間接ELISA方法的建立
　　為了建立穩(wěn)定可靠的DHBV血清學(xué)診斷方法，本研究利用重組表達(dá)的DHBV衣殼蛋白建立間接ELISA診斷方法。利用棋盤滴定法對(duì)抗原最佳包被量進(jìn)行了優(yōu)化，隨后對(duì)

4、抗原的包被時(shí)間、包被溫度進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)對(duì)間接ELISA方法中的封閉時(shí)間、二抗工作濃度等條件進(jìn)行了優(yōu)化。利用建立的ELISA方法對(duì)27份DHBV陰性血清進(jìn)行檢測，確定了判定樣品為陰性或陽性的臨界值，并通過該臨界值對(duì)建立的ELISA方法敏感性、特異性、重復(fù)性及可靠性等進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明，基于重組表達(dá)衣殼蛋白間接ELISA方法的最佳反應(yīng)條件為:抗原37℃包被2h后4℃過夜，6.7μg/孔;1％BSA37℃封閉2h;二抗工作濃度為1∶100

5、0;待檢血清稀釋至1∶160。根據(jù)確定的臨界值0.392，DHBV陽性血清能被檢測為陽性的最大稀釋倍數(shù)為1∶12800;重復(fù)性試驗(yàn)表明組內(nèi)、組間試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10％;該ELISA方法檢測常見鴨源病原抗血清時(shí)均無陽性結(jié)果;對(duì)75份臨床樣品進(jìn)行檢測時(shí)，與傳統(tǒng)的檢測方法PCR相比達(dá)到95.45％的符合率。說明該DHBV衣殼蛋白間接ELISA檢測方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。此外，本方法運(yùn)用羊抗鴨IgG抗體替代了兔抗鴨與羊抗

6、兔抗體的聯(lián)用，是該方法更為簡便快捷、節(jié)約成本。
　　3.PreC/C基因轉(zhuǎn)錄時(shí)相及表達(dá)時(shí)相的研究
　　DHBV基因組在復(fù)制的過程中會(huì)先轉(zhuǎn)錄形成一條長鏈RNA（preRNA），然后反轉(zhuǎn)錄形成DNA達(dá)到病毒基因組復(fù)制的目的。該長鏈RNA除了扮演DHBV基因組復(fù)制中間體的角色外，還能作為DHBV DNA多聚酶P蛋白的mRNA翻譯為P蛋白，或充當(dāng)DHBV PreC/C基因的mRNA，翻譯為DHBV的衣殼蛋白。本研究通過建立的DHBV

7、感染鴨原代細(xì)胞模型，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及相對(duì)定量分析方法，對(duì)preRNA在病毒感染細(xì)胞后的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行定量分析。在相同時(shí)間點(diǎn)，運(yùn)用間接免疫熒光及免疫印跡技術(shù)對(duì)DHBV衣殼蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，preRNA在病毒感染后的12h開始出現(xiàn)，20h達(dá)到最大峰值;而衣殼蛋白在病毒感染后的12h及20h并未被檢測到，直到24h才能被檢測到。說明preRNA在DHBV在體外感染細(xì)胞的早期并不用于衣殼蛋白的翻譯，該結(jié)論為DHBV病