具有群體感應(yīng)抑制活性的海洋細(xì)菌的篩選與活性物質(zhì)研究.pdf

1、細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重，傳統(tǒng)的抗菌藥物容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，要從根本上去除細(xì)菌的致病性還是要通過阻斷或改變其致病過程中必須的通路，使致病基因無法表達(dá)，這樣不僅消除了細(xì)菌的致病性，還確保了不會產(chǎn)生耐藥性問題。群體感應(yīng)調(diào)節(jié)著細(xì)菌諸多生理功能，而大多數(shù)細(xì)菌的致病性亦受到細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，通過研究細(xì)菌的群體感應(yīng)體系，建立科學(xué)的篩選模型，找到具有抑制細(xì)菌群體感應(yīng)活性的天然產(chǎn)物，是開發(fā)新型抗菌物質(zhì)的有效途徑。
　　 本論文以紫色桿菌

2、12472為報告菌，對從美國圣璜島海域海綿中分離出的272株細(xì)菌進(jìn)行群體感應(yīng)活性的篩選，獲得2株能有效抑制紫色桿菌12472群體感應(yīng)活性的菌株66和108，通過16SrDNA分析，鑒定了兩株細(xì)菌的種屬，選取108為研究目標(biāo)進(jìn)行下一步實驗;然后對108號菌發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成作了優(yōu)化，通過活性測試確定其最佳發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成;采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件對菌株108進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，活性物質(zhì)的粗分離，用薄層層析法確定了活性物質(zhì)的柱分離條件，對108

3、號菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行反相減壓柱分離，通過高效液相色譜法、核磁共振波譜法和GC-MS質(zhì)譜法鑒定了活性物質(zhì)的化學(xué)組成，為天然產(chǎn)物作為群體感應(yīng)抑制劑的研究提供了參考。主要結(jié)論如下:
　　 (1)運用濾紙片法，雙層軟瓊脂法和色素抑制法對分離自美國圣璜島海域海綿中的272株海洋細(xì)菌進(jìn)行了群體感應(yīng)抑制活性的篩選。結(jié)果表明，經(jīng)過多次濾紙片法重復(fù)實驗，有17株菌群體感應(yīng)活性較好，能有效抑制紫色桿菌12472群體感應(yīng)活性，其中66，74，108，5

4、52等菌效果較好，抑制半徑始終在2mm左右;經(jīng)過雙層軟瓊脂法實驗，證實有40株菌活性較好，其中大多數(shù)都是在濾紙片法中有較好活性的菌株;通過色素抑制法的篩選，發(fā)現(xiàn)108號菌株抑制效果最明顯，與空白對照相比較，抑制率達(dá)到20％左右。綜合各個方法篩選結(jié)果，選取66和108號菌株進(jìn)行菌種鑒定，并對108號菌進(jìn)行進(jìn)一步實驗。
　　 (2)對初篩和復(fù)篩選出的兩株高活性菌株66和108進(jìn)行16SrDNA分析，結(jié)果表明，66與表皮短桿菌（Bre

5、vibacterium epidermidisSW34）親緣關(guān)系最近，108與馬胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum subsps)親緣關(guān)系最近。
　　 (3)通過單因子實驗，對活性菌108的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化?？疾觳煌l(fā)酵時間、溫度、轉(zhuǎn)速、接種量、pH和培養(yǎng)基組成對菌株生長、代謝物產(chǎn)量、群體感應(yīng)抑制活性的影響。結(jié)果表明:108號菌株最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間36h，發(fā)酵溫度25℃，轉(zhuǎn)速120rpm，接種量5％，培

6、養(yǎng)基pH7;最佳培養(yǎng)基組成為蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，NaCl15g/L。
　　 (4)采用優(yōu)化的培養(yǎng)條件對菌株108進(jìn)行規(guī)模化培養(yǎng)，培養(yǎng)體積為45L，經(jīng)乙酸乙酯-丙酮萃取后，得到粗提物2.9g。將108的發(fā)酵產(chǎn)物初步分成極性不同的三相:正己烷相、二氯甲烷相和甲醇水相，運用濾紙片法進(jìn)行活性測試。結(jié)果顯示，活性組分主要集中于二氯甲烷相中。采用薄層層析法選擇分離108號菌活性產(chǎn)物的溶劑體系、溶劑比例及代謝物質(zhì)大致的極性段。結(jié)

7、果表明，丙酮和石油醚體系適于108二氯甲烷相的分離。用反相減壓柱進(jìn)行柱分離，分離條件為甲醇含量分別為10％、20％、40％、60％、95％和100％的梯度洗脫，對洗脫下的物質(zhì)進(jìn)行活性追蹤，發(fā)現(xiàn)60％甲醇水洗脫下的物質(zhì)具有最強(qiáng)的群體感應(yīng)抑制活性，在250μg/片的用量下，活性物質(zhì)對紫色桿菌素的抑制圈半徑達(dá)到7mm。高效液相色譜面積歸一化法結(jié)果顯示，活性產(chǎn)物含量為15.962％。核磁共振波譜（混合氫譜）和GC-MS質(zhì)譜初步分析結(jié)果，活性成分