拮抗植物病原真菌的海洋細(xì)菌篩選及其活性物質(zhì)研究.pdf

1、對危害嚴(yán)重并難以控制的農(nóng)作物病原真菌,急需尋找高效新型活性物質(zhì)。在陸地尋找概率越來越低的情況下,本研究以油菜菌核病和棉花枯萎病病原真菌為指示菌,對1021株海洋細(xì)菌進(jìn)行了抗菌篩選,從中得到了144株具抗菌活性的菌株,并對部分活性較好的假單胞菌株產(chǎn)活性物質(zhì)進(jìn)行了分子檢測,同時詳細(xì)研究了篩選得到的具有穩(wěn)定拮抗油菜菌核病的海洋假單胞菌YZSN25和拮抗水稻紋枯病的海洋糞產(chǎn)堿桿菌WL24。分別對其抗作物病原菌譜,拮抗活性物質(zhì)的分離、純化和初步鑒

2、定以及發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究,結(jié)果如下:
　　 (1)在篩選的168個屬中,活性菌株篩得率最高的屬分別是芽胞桿菌屬和假單胞菌屬。篩選的1021株海洋細(xì)菌中包括海洋假單胞屬菌株302株,得到了50株有活性的假單胞菌株。其中以不同來源的銅綠假單胞菌菌株篩選拮抗活性幾率和拮抗活性最高。同時對篩選得到的部分活性較強(qiáng)的19株假單胞菌進(jìn)行了活性物質(zhì)的分子檢測,分子檢測結(jié)果顯示:菌株1A06832和SH-46擴(kuò)增獲得了2,4-DAPG合成基因

3、的目的片段；菌株1A04311、1A05429和1A01321擴(kuò)增獲得了吩嗪合成基因的目的片段；1A06832、1A00318和SH-46擴(kuò)增獲得了藤黃綠膿菌素合成基因的目的片段；而硝吡咯菌素合成基因片段沒有獲得。
　　 (2)篩選得到的海洋菌YZSN25,經(jīng)生理生化鑒定和16S rRNA基因分子鑒定初步確認(rèn)屬于假單胞菌(Pseudomonas sp.),具體的種仍需進(jìn)一步實驗確定,菌株連續(xù)傳代10次遺傳穩(wěn)定性良好,其抑菌譜結(jié)果

4、顯示對油菜菌核病菌、水稻紋枯病、玉米小斑病菌、小麥赤霉菌、棉花立枯等植物病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用。
　　 (3)菌株YZSN25活性物質(zhì)理化性質(zhì)研究表明:對熱具有良好的穩(wěn)定性,對酸堿不敏感,在酸性條件下可形成沉淀,復(fù)溶后仍然具有原來的活性；經(jīng)紫外、蛋白酶、有機(jī)溶劑處理都顯示了較好的耐受性。硫酸銨鹽析活性組分分子量介于30 kDa-100 kDa之間,活性物質(zhì)經(jīng)固相萃取初步分離,由薄層層析實驗進(jìn)一步分離純化,經(jīng)水和茚三酮顯色法初步

5、確定為環(huán)脂肽類活性物質(zhì),同時獲得兩條Rf值分別為0.13(a)和0.29(b)的活性帶,活性組分后又經(jīng)高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用初步推測活性物質(zhì)a和b可能為相同分子量的一類新型環(huán)脂肽類活性物質(zhì),其具體的分子量和結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步確定。
　　 (4)菌株YZSN25發(fā)酵培養(yǎng)基條件單因素優(yōu)化實驗初步確定了發(fā)酵條件組合:培養(yǎng)基初始pH值為自然pH值,種子液接種菌齡為12 h,接種量為3.0％,250 mL發(fā)酵搖瓶裝液量為60 mL,發(fā)酵時間4

6、8 h,發(fā)酵溫度28℃,搖床培養(yǎng)振蕩頻率為180r/min。對油菜菌核病離體葉片防治實驗表明:活性物質(zhì)粗提物的濃度為100μg/mL時對油菜菌核病的防治效果達(dá)到87.7％。
　　 (5)篩選得到海洋菌WL24,經(jīng)生理生化鑒定和16S rRNA基因分析鑒定為糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis),經(jīng)連續(xù)傳代10次抑菌活性穩(wěn)定,其抑菌譜實驗表明對水稻紋枯病、柿子炭疽病、玉米小斑病及蔬菜灰霉病等多種植物病原真菌有較強(qiáng)拮

7、抗效果。
　　 (6)菌株WL24活性物質(zhì)的理化性質(zhì)研究結(jié)果表明:對熱不具有較好的穩(wěn)定性,60℃以上處理30 min活性下降迅速,對酸堿敏感在中性環(huán)境中較為穩(wěn)定,對紫外處理敏感,經(jīng)紫外光照射30 min時活性即下降37.2％,經(jīng)蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶處理后,其相應(yīng)的抑菌活性分別下降了31.6％、23.9％和21.3％。經(jīng)測定活性物質(zhì)在發(fā)酵周期為24 h達(dá)到最大值,而且抗菌活性的產(chǎn)生并不需要高濃度氯化鈉的誘導(dǎo)?；钚晕镔|(zhì)經(jīng)硫酸