顳下頜關(guān)節(jié)源性疼痛模型的建立及TNF-α和NF-κB的表達及意義.pdf

1、本研究通過建立顳下頜關(guān)節(jié)(TemporomandibularJoint，TMJ)源性關(guān)節(jié)痛模型，探討NF-κB、TNF-α在TMJ源性關(guān)節(jié)痛中的組織分布及表達水平的變化，為明確TMJ源性關(guān)節(jié)痛機制提供初步研究依據(jù)。 研究目的： 1.建立顳下頜關(guān)節(jié)源性關(guān)節(jié)痛模型。 2.探討NF-κB、TNF-α在TMJ源性關(guān)節(jié)痛中表達及意義。 研究材料與方法： 1.建立TMJ源性關(guān)節(jié)痛動物模型。 SD大鼠隨

2、機抽取50只作為實驗組，左側(cè)TMJ注入CFA(結(jié)核桿菌與油劑按1：1配制)50μL。分為實驗1組(5只不處死)，觀察TMJ源性關(guān)節(jié)痛自然過程；實驗2組(20只)不同時點處死，觀察炎癥程度的改變；實驗3組(20只)不同時點處死，觀察病理改變和fos蛋白的表達：實驗4組(5只)觀察機械異常性疼痛閾值。15只作為陰性對照組，左側(cè)TMJ注入生理鹽水50μL，陰性對照1組(5只)觀察炎癥程度的改變；陰性對照2組(5只)觀察病理改變和fos蛋白的表

3、達；陰性對照3組(5只)觀察機械異常性疼痛閾值。5只作為空白對照組不做任何處理。每天觀察動物的行為改變、體重變化、注射側(cè)關(guān)節(jié)區(qū)水腫及血淚癥。分別于2h、1天、3天、10天處死動物。其中實驗3組，陰性對照2組及空白對照組進行心臟灌注，收集TMJ組織標本進行病理分析，腦干及頸髓固定后在-20℃冰凍切片，免疫組化檢測fos蛋白。實驗2組、陰性對照1組、空白對照組也于同樣時點處死動物，處死動物前10分鐘通過尾靜脈注入伊文氏藍，取關(guān)節(jié)組織標本，確

4、定外滲范圍并測定伊文氏藍外滲濃度。 不同時點把vonfrey纖絲放在實驗4組、陰性對照3組雙側(cè)TMJ表面皮膚，檢測引起反應(yīng)的克數(shù)。纖絲逐漸遞增直到大鼠有后縮反應(yīng)。每個纖絲每次測試均以1.5秒的時間均勻施壓直到完全彎曲為止。重復(fù)5次，每次間隔5秒，能夠在五個大鼠的測試中產(chǎn)生三個后縮反應(yīng)的最小克數(shù)被認為是該時點的機械異常性疼痛閾值。 2.免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)TMJ源性關(guān)節(jié)痛動物模型20

5、只，2h、1d、3d、10d處死動物，收集的TMJ組織標本固定、包埋、切片，進行IHC染色，檢測TNF-α、NF-κB表達，光鏡下觀察。 3.酶聯(lián)免疫吸附實驗。 TMJ源性關(guān)節(jié)痛動物模型20只，同樣時點處死動物，收集關(guān)節(jié)標本，冰浴下勻漿、提取總蛋白、測定蛋白含量，ELISA檢測TNF-α濃度，計算細胞因子相當含量=細胞因子(pg/mL)/總蛋白(mg/mL)。 研究結(jié)果： 1.TMJ源性關(guān)節(jié)痛動物模型的確

6、立。 實驗組1d、3d、10d注射側(cè)TMJ均出現(xiàn)水腫和血淚癥，組織病理學檢測發(fā)現(xiàn)1天部分滑膜增生2～3層，3天滑膜明顯增生，10天滑膜增生成茸毛狀。TMJ后區(qū)水腫，大量炎癥細胞浸潤，纖維素性滲出。髁狀突無骨質(zhì)破壞。 2h、1d、3d伊文氏藍外滲濃度、fos蛋白表達水平逐漸升高與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)：第10天下降，但fos蛋白表達與對照組相比仍然有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，伊文氏藍則無統(tǒng)計學意義(P＞0

7、.05)。實驗組和陰性對照組體重在注射后7天均出現(xiàn)生長停滯現(xiàn)象，行為無明顯變化。 實驗組注射側(cè)2h可觀察到疼痛閾值降低，1d達到最低值，隨后逐漸上升，持續(xù)2周。與實驗組對側(cè)相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 2.IHC細胞因子分布特點。 實驗組TNF-α2h、1天、3天在外滲炎癥細胞、滑膜下層纖維原細胞、滑膜細胞、血管內(nèi)皮細胞均有表達。第10天滑膜細胞、滑膜下層纖維原細胞表達陰性，血管內(nèi)皮細胞、炎癥細胞表達陽性。

8、陰性對照組TNF-α反應(yīng)陰性。實驗組NF-κB2h、1天、3天在滑膜細胞和血管內(nèi)皮細胞核表達，且核內(nèi)表達逐漸升高，陰性對照組細胞質(zhì)有少量表達，實驗組與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。第10天NF-κB陽性表達與對照組無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 3.細胞因子TNF-α表達水平的檢測。 實驗組2h、1天、3天TNF-α表達水平逐漸升高，第三天達到最大值，第10天下降下降，與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

9、 4.NF-κB與TNF-α、NF-κB與fos蛋白的相關(guān)性分析NF-κB與TNF-α表達負相關(guān)(P=0.036，R=-0.496)；NF-κB與fos蛋白表達顯著相關(guān)(P=0.002，R=0.6782)。 研究結(jié)論： 1.CFA作為一種致痛物質(zhì)，可以引起TMJ慢性疼痛，且局限、固定、較輕，穩(wěn)定、持續(xù)時間較長，可以基本模擬臨床上TMJ源性關(guān)節(jié)疼痛，提示可以作為一個比較理想的TMJ慢性疼痛模型。 2.TMJ