HCV core抗原檢測(cè)系統(tǒng)的初步建立.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是一種小包膜RNA病毒，主要經(jīng)血液傳播，可引起急、慢性病毒性肝炎，并常導(dǎo)致慢性進(jìn)行性肝病，肝硬化(Hepatocellular cirrhosis，HC)，甚至肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)。目前全球約有1.23-1.7億人感染HCV，中國有近4千萬HCV感染者，是HCV流行較嚴(yán)重的國家之一。因此控制HCV的傳播已成為一個(gè)相當(dāng)嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。

2、目前血清的篩查多以檢測(cè)HCV抗體為主，但HCV抗體檢測(cè)一般存在7-10周的窗口期，仍威脅著用血安全。雖檢測(cè)HCV核酸可有效縮短窗口期，但因其操作復(fù)雜，容易污染且價(jià)格昂貴，使之不能廣泛應(yīng)用。HCVcore蛋白在HCV感染后體內(nèi)抗體陽轉(zhuǎn)前即可產(chǎn)生，是患者體內(nèi)HCV復(fù)制和HCV病毒載量的重要指標(biāo)。通過檢測(cè)患者體內(nèi)core蛋白可有效縮短HCV檢測(cè)窗口期，并可作為臨床HCV抗病毒治療效果評(píng)估的依據(jù)。因此本研究旨在初步建立HCVcore抗原檢測(cè)系統(tǒng)

3、，并為最終成功建立HCV Ag/Ab診斷試劑奠定基礎(chǔ)。 本研究首先構(gòu)建了非融合表達(dá)core區(qū)1-120aa的表達(dá)載體pTO-T7-C120，經(jīng)轉(zhuǎn)化：E.coli表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物約為13kD(命名為c120)。c120主要表達(dá)在上清中，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀及陽離子交換柱層析純化后，SDS-PAGE分析目的蛋白純度可達(dá)95％以上?？紤]到缺失C端的重組core抗原可能導(dǎo)致的構(gòu)像差異及表位缺失，本研究另外構(gòu)建了融合表達(dá)core區(qū)1-173aa

4、的表達(dá)載體pTrc-CKS-C173，并經(jīng)轉(zhuǎn)化E.coli表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物約為45kD(命名為cks-c173)。cks-c173主要表達(dá)在包涵體中，目的蛋白可溶于8M尿素，后經(jīng)電洗脫純化，SDS-PAGE分析目的蛋白純度可達(dá)97％以上。重組蛋白c120和cks-c173經(jīng)Western Blotting和間接ELISA驗(yàn)證表明均有良好的活性和特異性，適宜制備單抗。 然后將重組蛋白c120和cks-c173及贈(zèng)送重組core抗原c

5、ore-R分別免疫BALB/c小鼠，并利用常規(guī)單抗制備技術(shù)和間接ELISA法篩選單抗，最終成功獲得了103株抗HCV core抗原的單克隆抗體。單抗的滴度和亞型通過間接ELISA法分析。所有單抗經(jīng)條帶免疫印記實(shí)驗(yàn)證實(shí)均有良好的的活性。并利用HCV core區(qū)合成肽和間接ELISA鑒定出60株單抗的表位，共識(shí)別5個(gè)表位區(qū)。其中識(shí)別25-39aa和90-119aa的單抗最多，分別有25株和21株；識(shí)別49-78aa和17-31aa的單抗各有

6、9株和4株；另有1株單抗識(shí)別33-47aa。此結(jié)果同時(shí)反應(yīng)了重組core抗原的優(yōu)勢(shì)表位區(qū)，并發(fā)現(xiàn)3種core區(qū)重組蛋白暴露的優(yōu)勢(shì)表位存在差別。此外利用HCV core區(qū)合成肽和間接EIJSA分析HCV患者血清中抗HCV core不同區(qū)段抗體的豐度，發(fā)現(xiàn)HCV患者血清中core抗體的表位譜更寬，且可能更偏構(gòu)像依賴，其中49-78aa可能是天然core抗原一個(gè)重要的線性表位區(qū)。 最后，將103株卓抗通過正交雙抗體夾心ELISA檢測(cè)不

7、同稀釋度的c120蛋白以篩選出檢測(cè)c120靈敏度最高的配伍單抗。結(jié)果成功篩選到6組檢測(cè)c120靈敏度達(dá)100pg/mL。的配伍單抗，其中配伍83-65HRP的檢測(cè)靈敏度最高，可達(dá)50pg/mL。再利用這6組配伍單抗夾心檢測(cè)25份HCV抗體和PCR陽性血清中的core抗原，最終發(fā)現(xiàn)2組能高靈敏度檢測(cè)天然core抗原的配伍83-65HRP和97-65HRP，檢出率達(dá)8/25，并具有較好的特異性，初步建立了HCV core抗原的檢測(cè)系統(tǒng)。但因