埃他卡林對心肌和平滑肌ATP敏感性鉀通道基因表達的調(diào)節(jié)及其組織選擇性的研究.pdf

1、由內(nèi)向整流鉀通道Kir(inwardrectifierpotassiumchannel)亞基和磺酰脲類受體SUR(sulfonylureareceptor)亞基構(gòu)成的ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitivepotassiumchannels，KATP)是新型抗高血壓藥物——鉀通道開放劑(potassiumchannelopener,KCO)的作用靶點。但是，由于已有的鉀通道開放劑缺乏明確的組織選擇性，雖然有效降壓但卻引發(fā)各種副反應

2、，臨床上亟待新型鉀通道開放劑類化合物出現(xiàn)。埃他卡林(iptakalim，Ipt)不僅降壓作用確切、平穩(wěn)和持久，并且具在一定的選擇性作用特征：對心率影響輕；選擇性舒張小動脈而對大動脈的舒張作用無影響；不影響骨骼肌細胞KATP電流；在高血壓狀態(tài)下降壓作用強而不引起正常血壓的顯著下降，并逆轉(zhuǎn)高血壓心血管的結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu)?；谝陨涎芯勘尘?，本文旨在探討藥物引發(fā)功能變化后的基因表達變化，從基因表達的角度研究藥物作用的特征，為揭示埃他卡林的組織選擇

3、性提供實驗證據(jù)。 一、埃他卡林對正常血壓大鼠心肌、主動脈和尾動脈平滑肌KATP基因表達的調(diào)節(jié)利用反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈式反應(RT-PCR)研究埃他卡林對正常血壓大鼠(NTR)心血管組織中KATP亞基Kir6.1、Kir6.2、SUR1和SUR2基因表達的調(diào)節(jié)。 與正常對照相比，埃他卡林和陽性對照藥吡那地爾對心肌KATP亞基基因的表達無顯著影響(P＞0.05)。埃他卡林對主動脈平滑肌KATP基因表達無顯著影響(P＞0.05)；

4、吡那地爾使主動脈SUR2表達上升18.8％(P＜0.05)。尾動脈平滑肌上，埃他卡林顯著抑制Kir6.1和Kir6.2基因的表達，比正常對照下降37.1％和29.1％(P＜0.05)；吡那地爾使Kir6.1和SUR2表達較正常對照下降31.1％和20.0％(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，埃他卡林對心血管平滑肌KATP基因表達的影響具有組織選擇性，選擇性影響小動脈平滑肌KATP的Kir6.1/Kir6.2基因表達而對心肌和大動脈平滑肌KA

5、TP基因表達無影響；埃他卡林對大小動脈平滑肌KATP基因表達的影響不同于吡那地爾，吡那地爾既可調(diào)節(jié)小動脈又可調(diào)節(jié)大動脈平滑肌KATP基因表達，具有顯著影響大小動脈平滑肌SUR2基因表達變化的特征。 二、埃他卡林對高血壓大鼠心肌、主動脈和尾動脈平滑肌KATP基因表達的調(diào)節(jié)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)分為兩組：模型組(未治療的SHR組)和埃他卡林治療組。以同年齡體重的WKY為正常對照組。 與WKY相比，SHR的心肌、主動脈和尾

6、動脈平滑SUR2和Kir6.2的基因表達顯著升高(P＜0.05)。與未治療的SHR相比，埃他卡林顯著降低三種組織中SUR2和Kir6.2的基因表達(P＜0.05)。三種組織中Kir6.1基因的表達在模型組和給藥治療組中均無顯著性變化(P＞0.05)。因此高血壓時心血管KATP基因表達的特征性變化表現(xiàn)為：心肌和大小動脈平滑肌SUR2/Kir6.2基因表達的上行性調(diào)節(jié)，埃他卡林具有逆轉(zhuǎn)高血壓引起的SUR2和Kir6.2基因上行性表達的作用。

7、 三、埃他卡林對大鼠尾動脈平滑肌細胞內(nèi)鈣離子濃度、蛋白激酶A和C活性的影響 血管的舒縮與血管平滑肌細胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)關系密切，且受蛋白激酶A(PKA)和C(PKC)活性的調(diào)節(jié)。本實驗觀察埃他卡林對來源于大鼠尾動脈的小動脈平滑肌細胞(RTA-SMCs)中[Ca2+]i、PKA和PKC活性等藥理學特征的影響，比較它與氰胍類的吡那地爾和苯并噻二嗪類的二氮嗪(diazoxide，Dia)的作用特征，進一步探討埃他

8、卡林的選擇性作用機制。 1.埃他卡林對大鼠尾動脈平滑肌細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響埃他卡林由低至高濃度(0.1～10μmol·L-1)引起[Ca2+]i劑量依賴性降低(P＜0.05)。以KATP選擇性拮抗劑格列苯脲(glibenclamide，Gli，1μmol·L-1)預孵育，再連續(xù)給0.1和1μmol·L-1的埃他卡林，[Ca2+]i無顯著變化(P＞0.05)。同樣實驗條件下，0.1～10μmol·L-1的吡那地爾引起[Ca2+]

9、i劑量依賴性降低(P＜0.05)，并被1μmol·L-1格列苯脲所拮抗。0.1μmol·L-1的二氮嗪對[Ca2+]i無影響(P＞0.05)，但1和10μmol·L-1引起[Ca2]i顯著降低(P＜0.05)，并被格列苯脲拮抗。以上結(jié)果表明：埃他卡林可濃度依賴性的降低小動脈平滑肌細胞內(nèi)游離鈣離子濃度，并為格列苯脲所對抗；其作用的敏感性與吡那地爾相似，但比二氮嗪更敏感。 2.埃他卡林對尾動脈平滑肌細胞蛋白激酶A和C活性的影響與正常

10、對照相比，1μmol·L-1的埃他卡林使PKA、PKC活性升高36％和51％(P＜0.05)，吡那地爾使PKA、PKC活性升高39％和50％(P＜0.05)；二氮嗪對PKC有顯著影響，活性升高96％(P＜0.01)，但不影響PKA活性(P＞0.05)。因此埃他卡林對小動脈平滑肌細胞PKA和PKC活性的影響與吡那地爾相似，但不同于二氮嗪。 四、埃他卡林對大鼠胃、回腸和膀胱平滑肌張力的影響在廣泛存在的非血管平滑肌中，埃他卡林對KAT

11、P的作用尚未研究。本實驗采用離體張力實驗觀察埃他卡林對胃、回腸和膀胱平滑肌張力的影響，并與吡那地爾和二氮嗪進行比較研究，揭示埃他卡林在非血管平滑肌上的組織選擇性特征。 乙酰膽堿(10μmol·L-1)預收縮各離體標本，達最大幅度后再累積加入不同濃度的埃他卡林(0.01～100μmol·L-1)，回腸、胃和膀胱張力無變化。相同實驗條件下，二氮嗪對三種組織張力也無影響。吡那地爾對胃和膀胱張力無影響，但是在回腸平滑肌上，吡那地爾10和

12、100μmol·L-1引發(fā)的舒張率分別為28％和52％，顯著拮抗乙酰膽堿誘發(fā)的收縮反應，引發(fā)明顯的舒張作用。以上結(jié)果表明，埃他卡林對胃、回腸和膀胱等非血管平滑肌張力無影響，其作用特征與二氮嗪相似，但與吡那地爾不同；吡那地爾雖然對胃和膀胱平滑肌張力無影響，但具有擴張回腸平滑肌的作用。 五、埃他卡林對大鼠胃、回腸和膀胱平滑肌KATP基因表達的影響胃、回腸平滑肌的KATP亞型主要是SUR2和Kir6.1，膀胱平滑肌主要是SUR2和Ki

13、r6.2。與正常對照相比，埃他卡林和吡那地爾對胃和回腸KATP基因表達的影響無顯著性差異(P＞0.05)；埃他卡林使膀胱SUR2基因表達降低41％(P＜0.05)，Kir6.2基因表達升高43％(P＜0.05)，而吡那地爾只使SUR2基因表達降低44％(P＜0.05)。以上結(jié)果表明：埃他卡林和吡那地爾均不影響胃和回腸平滑肌KATP的基因表達，而選擇性調(diào)節(jié)膀胱平滑肌KATP的基因表達，但兩者的調(diào)節(jié)方式不同：埃他卡林下行性調(diào)節(jié)SUR2基因和

14、上行性調(diào)節(jié)Kir6.2的基因表達；吡那地爾不影響Kir6.2的基因表達，只下行性調(diào)節(jié)膀胱平滑肌SUR2的基因表達。 綜上所述，本研究結(jié)論如下：1.埃他卡林對心血管KATP基因表達的調(diào)節(jié)作用具有選擇性：選擇性下行性調(diào)節(jié)小動脈KATP基因表達；不影響心肌和大動脈平滑肌KATP的基因表達表達。2.埃他卡林對心血管KATP基因表達的選擇性調(diào)節(jié)作用不同于吡那地爾：選擇性下行性調(diào)節(jié)小動脈平滑肌Kir6.1/Kir6.2的基因表達；但吡那地爾

15、對大小動脈平滑肌KATP的基因表達均有調(diào)節(jié)作用，具有上行性調(diào)節(jié)大動脈平滑肌SUR2基因表達和下行性調(diào)節(jié)小動脈平滑肌SUR2/Kir6.1基因表達的特征。3.高血壓時心血管KATP基因表達的特征性變化表現(xiàn)為心肌和大小動脈平肌SUR2/Kir6.2的上行性調(diào)節(jié)，并可被埃他卡林所逆轉(zhuǎn)。4.埃他卡林對小動脈平滑肌的藥理學作用包括降低細胞內(nèi)鈣離子濃度，提高PKA和PKC的活性，其作用特征不同于二氮嗪，二氮嗪不影響PKA的活性。5.埃他卡林不影響胃