胚胎干細胞體外分化為腎小管上皮細胞分子機制及其在腎損傷修復中作用的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景和目的:由于抗生素以及抗腫瘤藥物的廣泛應用,而腎臟又是一個藥物毒性頻繁作用的器官,因此近年來藥物性腎損傷發(fā)病率逐年提高,已經(jīng)成為危害人們身體健康的一大疾病。由于腎小管上皮細胞對于許多藥物具有分泌和重吸收功能,因而細胞內藥物濃度較高,所以這一類疾病中,腎小管上皮細胞變性壞死發(fā)生率較高。藥物性腎損害程度較輕時,主要表現(xiàn)為急性腎小管損傷,損傷較重時表現(xiàn)為急性腎小管壞死。前者通常是可逆性的加上腎臟本身也具有一定的修復功能,因此可以通過適

2、當?shù)膶ΠY治療得到治愈;而后者常由于治療不及時而引起腎功能衰竭,最終導致患者死亡。目前對于腎功能衰竭常用的透析療法,如持續(xù)性的腎臟替補療法對于總的致死率沒有什么影響,而最有效的治療手段-腎臟移植,常常由于供體腎臟來源少,且引起免疫排斥反應從而導致治療效果較差,上述原因使得人們越來越關注細胞治療。ES細胞是從動物早期胚胎的內細胞團或原始生殖細胞分離出來的具有發(fā)育全能性的一種未分化的無限增殖的細胞系,具有向三個胚層分化的潛能。胚胎干細胞在體內

3、體外均能分化成各種類型的細胞,而在特定微環(huán)境中能向特定類型的細胞分化。這些顯著的特性使得ES細胞成為細胞治療的首選供體來源。到目前為止,誘導ES細胞定向分化的研究已取得了有意義的進展,但尚未見到誘導其分化為腎上皮細胞及其相關分化機制探討的報道。同時對于ES細胞在體內對藥物性腎損傷的治療作用也無報道。本研究將腎上皮細胞與胚胎干細胞共同培養(yǎng)并在培養(yǎng)基中添加不同的化學或生物試劑,其目的在于體外誘導胚胎干細胞向腎小管上皮樣細胞分化,并探討分化過

4、程中所涉及的分子機制;同時利用順鉑建立腎損傷小鼠模型,利用此模型初步探討胚胎干細胞對損傷腎的修復作用以及ES細胞在體內的分化情況。這一部分主要側重于修復作用的觀察。 第一部分:體外誘導胚胎干細胞向腎小管上皮樣細胞分化模型的建立方法:(1)條件培養(yǎng)基收集及配制:腎小管上皮細胞(TCMK-1)單層培養(yǎng)48小時后,收集培養(yǎng)基,離心,過濾,備用。將不含LIF的ES細胞培養(yǎng)基與腎小管上皮細胞培養(yǎng)基按3∶1混和,配制成條件培養(yǎng)基,4℃保存?zhèn)?/p>

5、用。(2)建立胚胎干細胞(ES)向腎小管上皮細胞(TCMK-1)分化體外模型:cellcultureinserts多孔膜做為基膜的替代物,將EScells懸浮培養(yǎng)形成的EBs和TCMK-1分別種在膜兩側,這兩種細胞可以經(jīng)膜上的孔(基膜上的窗孔)形成類似活體中細胞與細胞間樣接觸,同時TCMK-1細胞分泌的因子也可以通過窗口作用于ES細胞,此組做為接觸共培養(yǎng)組;將ES細胞形成EBs直接種在鋪有gelatin的平皿上,利用條件培養(yǎng)基進行誘導分

6、化培養(yǎng),此組作為條件培養(yǎng)基誘導組;將ES細胞形成EBs直接種在鋪有gelatin的平皿上,利用不合LIF的ES細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng),此組作為自由分化組。在0、4、7、10、13、16、19d用熒光顯微鏡,RT-PCR技術以及免疫熒光化學技術檢測細胞形態(tài)變化,腎臟發(fā)育相關基因表達情況,并在0、4、8、12、16、20、24d利用RT-PCR以及免疫熒光化學技術檢測腎上皮細胞特異性標志蛋白Ksp-cadherin的表達情況。 第二部分

7、:Wnt-4信號轉導通路在胚胎干細胞體外分化為腎小管上皮細胞過程中作用的研究方法:利用第一部分建立的誘導ES細胞向腎小管上皮細胞分化模型來研究Wnt信號轉導通路在ES細胞分化過程中的作用,在不同的時間點檢測Wnt信號轉導通路中重要分子以及腎臟發(fā)育相關基因的表達情況:設ES細胞與腎小管上皮細胞接觸共培養(yǎng)體系,將培養(yǎng)基中加入啟動Wnt信號轉導通路的化學物質LiCl作為LiClgroup;無LiCl作為Experimentgroup;培養(yǎng)基中

8、加入Wnt信號轉導通路的抑制物anti-wnt-4抗體作為anti-wnt-4group。檢測指標:(1)在誘導后不同的時間點即:3d,5d,7d,9d,11d,13d利用RT-PCR和Real-timePCR技術檢測EB中Pax-2,Wnt-4,F(xiàn)rizzled-4,F(xiàn)rizzled-6mRNA的表達情況,以及在3d,7d,11d,15d,19d,23d檢測Ksp-cadherinmRNA的表達情況;(2)觀察Wnt信號轉導通路信號分

9、子的表達情況:根據(jù)LiClgroupRT-PCR結果顯示的Wnt-4mRNA的表達時間,即從誘導后第5d,7d,9d,11d,13d利用免疫印跡法檢測β-catenin非磷酸化狀態(tài)的表達情況。(3)觀察Wnt-4信號轉導通路對ES細胞體外分化為腎上皮細胞的影響:同樣根據(jù)RT-PCR結果,在各組ES細胞分化不同時間點即:15d,19d,23d利用免疫組織熒光化學方法檢測ES細胞中Ksp-cadherin蛋白表達情況;利用流式細胞術檢測ES

10、細胞的分化率。結果:(1)RT-PCR實驗結果顯示,加入LiCl的ES細胞中腎臟發(fā)育相關基因即pax-2,wnt-4,frizzled和ksp-cadherin的表達時間均早于其他兩組(p<0.01),LiCl組中Pax-2mRNA于誘導后第3天開始表達,而兩外兩組均于第5天開始表達,LiCl組中此基因在誘導后第9天表達開始下降;Wnt-4mRNA在誘導后第5天開始表達,隨著分化時間的延長其表達量逐漸增加,實驗組和Anti-wnt-4組

11、此基因的表達時間分別為7天和11天;Frizzled-6mRNA的表達時間和趨勢與Wnt-4mRNA相似;實驗中我們未檢測出Frizzled-4mRNA的表達;Ksp-cadherinmRNA在LiCl組的表達時間為誘導后第11天,Experiment組表達此蛋白的時間為誘導后15天,表達量明顯低于LiCl組(p<0.01),Anti-wnt-4組中沒有此基因的表達。(2)Westernblotting實驗表明,LiCl組中在wnt-4

12、基因表達后,非磷酸化β-catenin的表達量開始逐漸增加,Experiment組此蛋白的表達趨勢與LiCl組中相似,但是表達量低于前一組(p<0.01)。Anti-wnt-4組中非磷酸化β-catenin的表達量低于前兩組,隨著細胞分化其表達量有下降的趨勢。(3)免疫熒光和流式細胞術結果顯示ksp-cadherin陽性細胞率在LiCl組中明顯高于實驗組(p<0.01)。結論:在實驗中我們利用氯化鋰抑制β-catenin的降解間接促進W

13、nt信號轉導通路,并利用Wnt-4抗體抑制Wnt信號轉導通路來觀察不同組ES細胞分化情況,從而分析此信號轉導通路的作用。結果發(fā)現(xiàn)氯化鋰組腎上皮細胞陽性率明顯高于實驗組,而有Wnt-4抗體組未檢測出腎上皮細胞,據(jù)上述結果我們認為在ES體外分化為腎上皮細胞的過程中,Wnt-4信號轉導通路發(fā)揮著重要的作用,同時Wnt-4與其受體Frizzled-6而不是Frizzled-4結合啟動經(jīng)典的信號轉導通路通過改變β-catenin的表達發(fā)揮著重要作

14、用。 第三部分:ES細胞在小鼠急性腎小管壞死修復中的作用方法:選取2月齡的BALB/C雌性或雄性小鼠,按12.7mg/kg經(jīng)小鼠尾靜脈注射順鉑,建立藥物性急性腎損傷小鼠模型。將ES細胞、腎小管上皮細胞以及生理鹽水同樣經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內,分別設為ES細胞治療組、腎小管上皮細胞治療組和生理鹽水注射組。一段時間后,HE染色檢測小鼠腎臟病理變化;抽血檢測小鼠血常規(guī)、血中尿素氮和肌酐的變化;RT-PCR檢測GFP基因的表達情況;免疫熒光

15、技術檢測小鼠腎臟中GFP的表達情況。結果:HE染色結果表明:藥物注射后第4天,小鼠腎臟病理解剖結果腎小管上皮細胞呈空泡樣變性,部分細胞壞死脫落入管腔,基底膜暴露;28天時腎損傷逐漸修復。血液學檢測結果發(fā)現(xiàn):ES細胞注射后第4天,實驗組小鼠血中BUN、Scr的表達水平明顯低于對照組;ES細胞植入損傷小鼠后5天,RT-PCR檢測出小鼠GFPmRNA的表達;第6天免疫熒光檢測出小鼠腎臟中有GFP蛋白的表達。結論:在本部分實驗中,我們成功的建立

16、了藥物性急性腎損傷小鼠模型,并利用此模型研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞在體內也能分化成腎小管上皮細胞,胚胎干細胞的此分化能力具有很強的環(huán)境依賴性。腎臟內的局部微環(huán)境對胚胎干細胞向腎小管上皮細胞分化的潛能中發(fā)揮著重要作用。因此胚胎干細胞有望成為急性腎功能衰竭的細胞替代治療的重要來源。 創(chuàng)新點和意義:1、本研究首次體外模擬體內腎臟微環(huán)境誘導胚胎干細胞分化為腎小管上皮樣細胞,為探索腎臟發(fā)育機制打下基礎。該模型的建立和對ES分化為腎小管上皮細胞機制

17、的研究,必將促進急性腎衰等相關的臨床研究的發(fā)展,并推動其臨床應用。2、我們的實驗結果證明Wnt-4信號轉導通路在ES細胞體外分化為腎上皮細胞的過程中發(fā)揮著重要作用。我們首次發(fā)現(xiàn)在體外ES細胞分化為腎上皮細胞的過程中,Wnt-4與其受體Frizzled-6而不是Frizzled-4結合,通過促進β-catenin非磷酸化狀態(tài)的表達,即通過經(jīng)典的Wnt信號轉導通路發(fā)揮作用。3、首次研究了胚胎干細胞在藥物性急性腎損傷中的治療作用,這必將推動胚

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