家蠶AP-4基因與Bmfez1基因的克隆及分析.pdf

1、果蠅的研究證明，胚胎發(fā)育的啟動(dòng)、體軸的建立等重要發(fā)育過程主要依靠母體來源的mRNA即母性基因的作用而實(shí)現(xiàn)。家蠶(Bombyx mori)作為鱗翅目昆蟲的模式生物，其早期胚胎發(fā)生與果蠅相比具有顯著的差異性，研究家蠶的母性基因，對于了解家蠶胚胎發(fā)育的分子機(jī)制十分重要，也將對鱗翅目昆蟲的發(fā)育與種群的遺傳控制技術(shù)研究提供參考。 本研究根據(jù)家蠶表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫，結(jié)合利用生物信息學(xué)技術(shù)和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，從家

2、蠶p50品種的未受精卵克隆獲得了家蠶兩個(gè)新基因的全長cDNA序列，對所獲得的序列進(jìn)行開放閱讀框、外顯子和內(nèi)含子分析，預(yù)測了蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域并進(jìn)行了分子進(jìn)化分析。主要研究結(jié)論如下： 一、家蠶AP-4(Activator Protein4)基因的克隆與分析 1.克隆獲得了家蠶AP-4基因全長cDNA。長度為1621bp，其中包括318bp的5'端非編碼區(qū)(5'UTR)、993bp的蛋白質(zhì)編碼區(qū)、終止密碼子TGA和3

3、07bp的3'端非編碼區(qū)(3'UTR)。ORF從cDNA的319位起，在1314位終止，長度為996bp，編碼331個(gè)氨基酸。 2.家蠶AP-4基因ORF位于家蠶基因組Ctg022100(GenBankNo：AADK01022100)的1430～5674bp之間。該基因由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，內(nèi)含子長度分別為2763bp和481bp，3個(gè)外顯子分別位于cDNA的1～407位，408～570位，571～1621位。

4、3.對赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)、蜜蜂(Apismellifera)、家蠶、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)和人(Homosapiens)的AP-4同源氨基酸序列進(jìn)行比對分析表明，各物種在45-99Aa區(qū)域高度相似，表明該區(qū)域有很高的保守性，是一個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)域，推測其在AP-4的生物學(xué)功能實(shí)現(xiàn)上起到重要作用。對AP-4的分子進(jìn)化分析表明，家蠶AP-4蛋白氨基酸序列與棉鈴蟲AP-4蛋白進(jìn)化關(guān)系最近

5、，蛋白同源性達(dá)76％，分值為449，e值為4e-124。 4.利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)分析了家蠶AP-4基因在不同發(fā)育時(shí)期的的表達(dá)水平。該基因在所檢測家蠶的各發(fā)育時(shí)期中，除蟻蠶和蛹期第4天未能檢測到表達(dá)外，其它時(shí)期均有表達(dá)，其中幼蟲3齡和4齡期的表達(dá)量較高。推測家蠶AP-4基因可能是以一種短暫的、不連續(xù)的表達(dá)模式發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。 二、家蠶Bmfezl基因的克隆與分析 1.克隆獲得了家蠶Bmfezl基因全長cD

6、NA。長度為1823bp，其中包括184bp的5'端非編碼區(qū)(5'UTR)、1383bp的蛋白質(zhì)編碼區(qū)、終止密碼子TAA、228bp的3'端非編碼區(qū)(3'UTR)和25bp的polyA尾。ORF從cDNA的185位起始，在1.569位終止，長度為1386bp，編碼461個(gè)氨基酸。 2.家蠶Bmfezl基因由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，初步分析該基因覆蓋了至少兩個(gè)家蠶基因組Scaffold000276(GenBankNo：CH37

7、9861.1)和Scaffold000435(GenBankNo：CH380020.1)。 3.對家蠶Bmfezl基因cDNA編碼的蛋白質(zhì)利用ExPASy進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)在205-435Aa區(qū)域存在典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域fezl。家蠶Bmfezl基因編碼蛋白的分子進(jìn)化分析結(jié)果表明，家蠶Bmfezl基因編碼蛋白與推定的赤擬谷盜(Triboliumcaslaneum)腫瘤抑制因子2(tumorsuppressor2；ref｜XP