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文檔簡介
1、研究背景:
毛囊是人體最為復雜的微小器官之一,其最主要的功能就是生長毛發(fā)。毛發(fā)對身體主要有人體防護、保溫、掩飾、分泌汗液和皮脂、感覺和傳導信息的作用,其中,最主要的作用是增加信息交流及傳遞美感。禿發(fā)及多毛癥目前是個世界性的難題,根據(jù)一項統(tǒng)計,全世界大約50%的成年人均要面對雄激素源性脫發(fā)這個棘手問題。盡管毛發(fā)疾病一般不威脅人體生命,但是其對人們的心理沖擊卻是難以估量的。由于對毛囊發(fā)生、發(fā)育和生長周期的調控機制尚不完全清楚,
2、迄今為止,醫(yī)學界對上述疾患仍無十分臺效的治療方法。因此,了解毛發(fā)的發(fā)育及再生機制、實現(xiàn)毛發(fā)的高效再生是近年來的一件迫在眉睫的難題。
在胚胎發(fā)育期間,毛囊的形態(tài)發(fā)生依賴于真皮和表皮間一系列信號的調控,它們介導了兩個細胞群體之間的相互作用,誘導兩個細胞群體有序增殖和分化,引導細胞最終形成毛干、根鞘和毛乳頭。這些信號包括Wnt/Wingless家族、成纖維細胞生長因子家族(FGFs)、骨形成蛋白家族(BMPs)、外胚葉發(fā)育不全基
3、因(Eda/Edar)、轉化生長因子β2(TGF-β2)、Sonic Hedgehog(Shh)等。其中,許多基因敲除和轉基因的動物模型提示W(wǎng)nt信號是促進毛囊發(fā)育的關鍵因子。
Wnt家族蛋白與果蠅Wingless蛋白同源,是一類脂質修飾的分泌型糖蛋白家族。Wnt信號通路可分為3個分支:Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路、Wnt/平面細胞通路、Wnt/Ca2+通路。其中,Wnt/β-catenini通路通過調控
4、細胞漿中β-catenin的水平濃度而發(fā)揮作用,當Wnt信號不存在時,細胞漿中的β-catenin很快就被降解;當Wnt信號存在時,Wnt信號抑制β-catenin被降解,在細胞漿中積聚并部分轉移到胞核,啟動相關基因的表達。Wnt信號決定了未分化表皮細胞的命運。在轉基因小鼠中,當表皮細胞被強行表達Wnt信號的抑制劑Dkkl或者表皮細胞缺少β-catenin時,所有的毛囊缺失;相反,當表皮細胞被強行表達β-catenin時,毛囊發(fā)育異常增
5、多。然而,人和小鼠的Wnt家族成員有19種之多,究竟是哪一種或者幾種Wnt蛋白在毛囊形成中有效發(fā)揮以及如何發(fā)揮其作用仍未明了。
對在小鼠身上有表達的所有Wnt成員進行全面檢測分析,包括小鼠胚胎皮膚和出生后的皮膚在內,只有Wnt10b、Wnt10a、Wnt5a在毛囊的發(fā)育早期特異表達,其中,Wnt10b在胚胎皮膚毛囊發(fā)育啟動和成年毛囊再生啟動時表達尤其明顯。不僅如此,一些實驗提示外源性Wnt10b蛋白能夠促進體外培養(yǎng)的小鼠胚
6、胎皮膚毛囊的發(fā)育,在Wnt3、Wnt5a、Wnt11和Wnt10b這幾個Wnt成員當中,只有Wnt10b具有誘導未成熟表皮細胞向毛干及內根鞘細胞分化,和刺激體外培養(yǎng)的毛囊毛干生長的能力。據(jù)此,我們推測:Wnt10b極有可能促使β-catenin在表皮和(或)真皮細胞胞漿積聚并核轉移,啟動相關基因的表達,繼而誘導毛囊的發(fā)育,對其功能的進一步研究,將有助于開發(fā)針對毛發(fā)疾病的新療法。
為了進一步闡明Wnt10b在毛囊發(fā)育過程中的
7、具體作用,我們首先觀察Wnt10b/β-catenin在大鼠胚胎皮膚毛囊形態(tài)發(fā)生過程中的動態(tài)表達;同時,體外構建適合研究毛囊發(fā)育啟動的胎鼠皮膚培養(yǎng)模型,該模型不僅毛囊短期發(fā)育與體內一致,而且培養(yǎng)條件穩(wěn)定、便于實驗干預;然后利用基因工程技術構建重組Writ10b蛋白,接著將重組Wnt10b蛋白和RNA干擾技術與培養(yǎng)模型結合,分別模擬基因調控技術中的功能獲得性突變和功能缺失性突變,探討胎鼠皮膚Wnt10b蛋白的表達強弱與毛囊發(fā)育啟動中基板形
8、成及其分布的關系。
第一章 大鼠胚胎皮膚毛囊形態(tài)發(fā)生與Wnt10b/β-catenin的表達
目的:
觀察SD大鼠胚胎背部皮膚毛囊的形態(tài)發(fā)生和Wnt10b/β-catenin信號在毛囊發(fā)育過程中的表達。
方法
取胎齡13~20d的SD大鼠胚胎及1.3d新生鼠的背部皮膚,采用石蠟包埋、切片、HE染色,對SD大鼠胚胎皮膚毛囊的發(fā)生過程及其形態(tài)學特征進行描述,同時應用熒光免
9、疫組化染色,觀察Wn10b及β-catenin在毛囊發(fā)育過程中的時空表達。
結論
SD大鼠背部皮膚最早期的毛囊發(fā)育啟動于胎齡15.5~16d,基木結束于出生后第3d;Wnt10b及β-catenin參與啟動毛囊的形態(tài)發(fā)生和毛囊的進一步發(fā)育。
第二章 大鼠毛囊發(fā)育啟動階段模型構建及其Wnt10b/β-catenin信號表達的觀察
目的:
構建適合研究毛囊發(fā)育啟動的胎鼠皮
10、膚體外器官培養(yǎng)模型,觀察Wnt10b/β-catenin信號在該模型毛囊發(fā)育過程中的時空表達。
方法
將胎齡14d~17d的胎鼠背部皮膚以明膠海綿為載體,在DMEM培養(yǎng)液的氣液交界平面中漂浮培養(yǎng)3-6d,石蠟包埋、切片、HE染色,觀察毛囊發(fā)育并與體內毛囊發(fā)育橫向比較;免疫熒光法動態(tài)觀察Wnt10b及β-catenin在該模型毛囊發(fā)育過程中的時空表達;將胎齡15d的胎鼠背部皮膚在含不同胎牛血清濃度的DMEM中培
11、養(yǎng),3d后取出皮膚組織、石蠟包埋、切片、HE染色,鏡下觀察各組毛囊數(shù)量并做統(tǒng)計學處理。
結論
在體外短期培養(yǎng)的胎鼠背部皮膚毛囊發(fā)育及Wnt10b/β-catenin信號的表達與體內基本一致,可以作為研究毛囊發(fā)育啟動的模型;Wnt10b/β-catenin信號的表達與毛囊的發(fā)育密切相關。
第三章 Wnt10b蛋白促進大鼠胚胎皮膚毛囊發(fā)育及其機制的初步探討
第一節(jié) 人Wnt10b基因真
12、核表達載體的構建及其在COS-7細胞中的表達
目的:
利用基因工程技術獲得人Wnt10b基因真核表達載體,將其轉染COS-7細胞并檢測其在COS-7細胞中的表達。
方法
以pUC19-Wnt10b模板,設計引物并進行PCR擴增出1170 bp的人Wnt10b基因的cDNA編碼區(qū)序列,然后將PCR產(chǎn)物純化、純化后的PCR產(chǎn)物和pEGFP-N1載體分別用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ進行酶切
13、,再次純化以上兩種酶切產(chǎn)物并回收,用T4DNA連接酶將兩種純化后的酶切產(chǎn)物進行連接,連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α,經(jīng)過菌落PCR,酶切鑒定后送去英駿公司測序鑒定;用脂質體LipofectamineTM2000將鑒定正確的載體轉染入COS-7細胞中,用Western blot和免疫細胞化學方法檢測COS-7細胞Wnt10b蛋白表達情況。
結論
本研究成功構建了包含人Wnt10b基因的pEGFP-N1-Wnt10
14、b真核表達載體;將pEGFP-N1-Wnt10b轉染COS-7細胞,COS-7細胞能夠表達重組Wnt10b蛋白,這為研究Wnt10b在毛囊發(fā)育過程中的作用及其機制提供一個有利的研究工具。
第二節(jié) 重組人Wnt10b蛋白促進大鼠胚胎皮膚毛囊發(fā)育的初步探討
目的:
觀察基因工程重組的人Wnt10b蛋白能否促進大鼠胚胎皮膚毛囊的發(fā)育和探討其潛在機制。
方法
將pEGFP-N
15、1-Wnt10b體外轉染COS-7細胞,轉染成功后繼續(xù)用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),每天收集培養(yǎng)上清液,制備含有Wnt10b蛋白的DMEM培養(yǎng)液;將胎齡14.5~15d的胎鼠背部皮膚置于含有Wnt10b蛋白的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)3d,在培養(yǎng)的第48h取出部分組織用Western blot檢測Wnt10b蛋白和β-catenin的含量;在培養(yǎng)的第72h,將皮膚組織取出石蠟包埋、切片,HE染色,鏡下觀察各組毛囊發(fā)育情況并做統(tǒng)計學處理。
16、 結論
當胎鼠背部皮膚在體外培養(yǎng)時,Wnt10b蛋白促進皮膚的毛囊發(fā)育,而且,Wnt10b蛋白很可能通過經(jīng)典的Writ信號通路調控細胞β-catenin水平來發(fā)揮作用的。
第四章 靶向Wnt10b的siRNA抑制胚胎皮膚毛囊發(fā)育的初步研究
目的:
利用RNA干擾技術抑制體外培養(yǎng)的胎鼠皮膚Wnt10b蛋白的表達,觀察沉默Wnt10b基因的表達能否抑制毛囊的發(fā)育和探討其潛在機制。
17、> 方法
采用廣州銳博生物科技有限公司提供的3條siRNA-Wnt10b正反義鏈和1條陰性對照的正反義鏈;按分組將胎齡14.5~15d的胎鼠背部皮膚置于含有siRNA/LipofectamineTm2000復合物的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng),24h后更換為含1O%FBS的DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48h。分別在培養(yǎng)的第24h、48h和72h取出部分組織用熒光定量PCR檢測皮膚組織Wnt10b和β-catenin的mRNA表達
18、;在培養(yǎng)的第72h,取出部分組織用Western blot檢測皮膚組織Wnt10b和β-catenin的蛋白含量。將上述方法篩選出的最佳序列和對照組再次重復上述步驟培養(yǎng),72h后取出皮膚組織石蠟包埋、切片,HE染色,鏡下觀察各組毛囊發(fā)育情況并做統(tǒng)計學處理。
結論
在體外器官培養(yǎng)的環(huán)境中,siRNA能夠抑制胎鼠背部皮膚組織Wnt10b蛋白的表達,從而抑制毛囊發(fā)育的啟動,減少新形成毛囊的數(shù)量;siRNA與胎鼠皮膚
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