MSM人群中HIV感染者Tim-3受體及其配體Gal-9對NK細胞功能的影響.pdf

1、目的：
　　人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染可引起以CD4+T細胞減少為主要特征的獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)。
　　T細胞免疫球蛋白區(qū)和黏蛋白區(qū)(T cell immunoglobulin domain and mucin domain，Tim)基因家族包括3個成員:Tim-1、Tim-3和Ti

2、m-4。Tim-3主要表達在已分化的CD4+1型輔助性T細胞(Th1)和CD8+1型細胞毒性T細胞(CTL)，少量表達于Th17細胞。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)Tim-3在固有免疫系統(tǒng)的細胞，尤其是在NK細胞有較高表達。Tim-3是T細胞重要的負性調控因子，可使T細胞功能減退進而加重慢性病毒感染。在HIV感染中，Tim-3在CD8+T細胞的表達量增加，使病毒特異性CD8+T細胞的增殖和分泌細胞因子能力都降低，導致CD4+T細胞計數的降低和病毒載量的升

3、高。Tim-3的配體——半乳凝集素-9(galectin-9，Gal-9)，是一種S型外源性凝集素，廣泛表達于多種免疫細胞，通過與Tim-3的結合誘導Tim-3+T細胞的死亡。盡管表達于T細胞的Tim-3可負向調控細胞功能，但表達于固有免疫細胞的Tim-3在免疫調節(jié)方面的作用目前仍存在爭議。有研究顯示，表達在樹突狀細胞和巨噬細胞的Tim-3能夠增強炎癥反應。自然殺傷細胞(natrual killer cell，NK)屬于淋巴細胞的一個亞

4、群，是固有免疫應答中一類重要的效應細胞，主要通過細胞毒性作用和分泌細胞因子發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤作用。HIV-1感染者外周血NK細胞胞內儲存的穿孔素和顆粒酶A減少、活化與抑制性受體表達異常，使HIV感染者NK細胞細胞毒性下降從而影響機體對病毒的清除。目前，Tim-3對NK細胞產生何種影響還不明確，Tim-3+NK細胞的研究僅見幾篇報道，且局限在健康人群和慢性乙型肝炎等少數幾種疾病。在HIV感染中Tim-3及其配體Gal-9對NK細胞是否發(fā)揮

5、作用、作用機制如何以及對疾病進展有何影響尚無明確結論，相關報道僅有2篇，有待更為系統(tǒng)性的深入研究。
　　近年來MSM(men who have sex with men，MSM)人群中的HIV感染者已成為我國HIV新發(fā)感染主體，且此人群中HIV感染者疾病進展較快。因此，本研究擬探索MSM人群中HIV感染者Tim-3及其配體Gal-9對NK細胞細胞因子(IFN-γ)分泌和脫顆粒(CD107a)功能的影響，為明確HIV感染的致病機制提

6、供依據。
　　材料與方法：
　　1、研究對象
　　本研究共選取實驗對象41例，其中，HIV抗體陰性的健康人13例;根據中華人民共和國國家HIV/AIDS診斷標準，選擇未接受過抗逆轉錄病毒治療的HIV慢性感染者28例。
　　(1) HIV抗體陰性健康人(HIV-negative normal control，NC):13例入選標準:HIV抗體陰性健康人群，血常規(guī)及肝功正常、乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性，無免

7、疫系統(tǒng)疾病。
　　(2) HIV慢性感染者:28例
　　入選標準:均來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診MSM人群的HIV感染者，未接受HAART治療，感染時間一年以上。其中按CID4-T細胞數量高低分為兩實驗組，其中CD4-T細胞數量大于350細胞/ul為高CD4組(CD4 high)，小于350細胞/ul為低CD4組(CD4 low)，高CD4組(CD4 high)15例，低CD4組(CD4 low)13例。
　

8、　2、CD4+T細胞絕對計數
　　在絕對計數管中加入20ul CD4/CD8/CD3TriTEST試劑，再用逆向加樣法加入50ul混勻的待測抗凝全血，在室溫下避光染色15分鐘，然后加入1×BD免洗溶血素450ul，在室溫下避光溶血15分鐘，再用FACSCalibur流式細胞儀中的MultiSET軟件進行檢測并自動分析，獲得CD4+T細胞數量的絕對值。
　　3、HIV病毒載量測定
　　采用Roche公司The COBAS

9、(@)AmpliPrep(@)/COBAS(@) TaqMan(@) HIV-1 Test，v2.0試劑盒在COBAS(@) TaqMan(@)系統(tǒng)進行全自動PCR反應體系制備及病毒載量檢測。檢測下限為20拷貝/ml。
　　4、NK細胞Tim-3及其配體Gal-9表達的檢測
　　用抗CD3-FITC、CD4-PEcy7、CD16-PerCP、CD56-PEcy7、Lineage-FITC(、HLA-DR-PerCP、Tim-

10、3-PE和Gal-9APC(或Gal9-PE)熒光抗體對凍存復蘇后的外周血單個核細胞(PBMC)進行表面染色，室溫避光20分鐘，PBS洗滌一遍，用1％的多聚甲醛固定細胞，上機檢測NK細胞Tim-3與Gal-9表達、CD4+T細胞和DC細胞Gal-9表達情況，用LSRⅡ流式細胞儀中的BD FACSDivaTM軟件進行檢測分析。
　　5、NK細胞功能的檢測
　　將凍存復蘇后的PBMC稀釋后加入96微孔板，每孔100ul，再加入抗

11、CD107a-APC-H7和Brefeldin-A(1)ul/ml或Monensin0.7ul/ml，同時加入刺激物IL-12+IL-15(10ng/ul和50ng/ul)或PMA/ION或K562細胞，于二氧化碳(5％)培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)6h。收集細胞，用抗CD3-FITC、CD16-PerCP、CD56-PEcy7和Tim-3-PE熒光抗體對細胞進行表面染色，然后破膜，熒光標記單克隆抗體IFN-γ-APC胞內染色，用1％的多聚甲醛固定

12、細胞，上機檢測胞內細胞因子(IFNγ)分泌及脫顆粒(CD107a)情況。用LSRⅡ流式細胞儀中的BD FACSDivaTM軟件進行檢測分析。
　　6、Tim-3受體阻斷實驗
　　將凍存復蘇后的PBMC稀釋后加入96微孔板，每孔100ul，再加入抗CD107a-APC-H7和Brefeldin-A1ul/ml或Monensin0.7ul/ml，同時加入刺激物IL-12+IL15(10ng/ul和50ng/ul)及anti-Ti

13、m-3，于二氧化碳(5％)培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)6h。收集細胞，用抗CD3-FITC、CD16-PerCP、CD56-PEcy7和Tim-3-PE熒光抗體對細胞進行表面染色，然后破膜，熒光標記單克隆抗體IFN-γ-APC胞內染色，用1％的多聚甲醛固定細胞，上機檢測胞內細胞因子(IFN-γ)分泌及脫顆粒(CD107a)情況。用LSRⅡ流式細胞儀中的BD FACSDivaTM軟件進行檢測分析。
　　7、統(tǒng)計學分析
　　應用SPSS17

14、.0軟件包進行統(tǒng)計分析，所有數據以中位數表示，兩組間實驗指標的比較采用Mann-Whitney U檢驗，相關性分析采用Spearman秩相關檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　實驗結果：
　　一、HIV感染后Tim-3受體在NK細胞的表達減少
　　HIV組總NK細胞(Total NKcell)、CD56dimNK及CD56-CD16+NK細胞的Tim-3百分數低于NC組(p=0.0224，p=0.0369，p=0.

15、0104)，其中CD4低組Tim-3+TotalNK細胞、Tim-3+CD56dimNK細胞、Tim-3+CD56-CD16+ NK細胞及CD4高組Tim-3-CD56-CD16+NK細胞百分比低于NC組(p=0.0159，p=0.0483，p=0.0455，p=0.0166)。HIV組、CD4高組和CD4低組CD56-CD16+NK細胞的Tim-3平均熒光強度均低于NC組(p=0.0179，p=0.0404，p=0.0427)。

16、>　　二、HIV感染后NK細胞分泌IFN-γ的功能降低
　　總NK細胞分泌的IFN-γ百分數中，NC組均高于HIV組、CD4高組和CD4低組(p＜0.0001, p=0.0007, p=0.0003), Tim-3+NK細胞(p＜0.0001, p=0.0007, p=0.0006)和Tim-3-NK細胞(p＜0.0001，p=0.0027，p＜0.0001)分泌IFN-γ百分數也均呈此趨勢。
　　三、阻斷Tim-3受體對N

17、K細胞分泌IFN-γ的影響無明顯變化
　　使用anti-Tim-3單克隆抗體對正常人NK細胞Tim-3受體進行體外阻斷實驗，結果發(fā)現(xiàn)阻斷NK細胞Tim-3之后，細胞分泌IFN-γ的百分數并無明顯變化。
　　四、HIV感染后Gal-9在CD4+T細胞的表達增加
　　HIV組、CD4高組和CD4低組Gal-9-CD4+T細胞百分數均高于NC組(p＜0.0001，p=0.0011，p＜0.0001)，且CD4低組高于CD4高

18、組(p=0.0106)。HIV感染者DC細胞Gal-9平均熒光強度也升高，且CD4低組高于NC組(p=0.0312)。
　　五、HIV感染者CD4+T細胞Gal-9表達與疾病嚴重程度有關
　　Gal-9+CD4+T細胞百分數與CD4+T細胞絕對數呈負相關(p=0.0343)，與病毒載量呈正相關(p=0.0484)，Gal-9在CD4+T細胞的平均熒光強度與病毒載量(LgVL)呈正相關(p=0.0364)。所以我們認為CD4+

19、T細胞Gal-9表達與疾病嚴重程度有關。
　　六、HIV感染者CD4+T細胞Gal-9表達與NK細胞分泌IFN-γ功能呈負相關
　　在HIV組、CD4高組和CD4低組Gal-9+CD4+T細胞百分數均與總NK細胞分泌的IFN-γ百分數均呈負相關(p=0.0007，p=0.0407，p=0.0019)。
　　七、Tim-3-/+NK細胞功能特性研究
　　1、細胞因子(IL-12+IL-15)刺激HIV感染者NK細胞

20、功能
　　Tim-3+NK細胞和Tim-3(-)NK細胞均可分泌IFN-γ，且兩者分泌IFN-γ百分數無顯著性差異(p=0.9542)。但是，CD107a絕大部分由Tim-3-NK細胞釋放，且Tim-3-NK細胞釋放CD107a百分數顯著高于Tim-3+NK細胞(p＜0.0001)。因此我們認為，細胞因子(IL-12+IL-15)刺激時，Tim-3+NK細胞是一群能夠分泌IFN-γ但幾乎不具有脫顆粒(CD107a)功能的細胞。

21、r>　　2、不同刺激物對健康人NK細胞功能的影響
　　細胞因子(IL-12+IL-15)刺激后，Tim-3+NK細胞和Tim-3-NK細胞均可以分泌IFN-γ，而Tim-3+NK細胞不釋放CD107a，Tim-3NK細胞可以釋放CD107a。PMA刺激后，只有Tim-3NK細胞分泌IFN-γ并釋放CD107a。K562細胞刺激時后，大部分IFN-γ和CD107a由Tim-3-NK細胞分泌及釋放，少部分由Tim-3+NK細胞分泌及釋

22、放。采用不同濃度PMA刺激后，Tim-3+NK細胞百分比隨PMA濃度增大而減少，IFN-γ+Tim-3-NK細胞百分比隨PMA濃度增大而增大，而Tim-3+NK細胞幾乎不分泌IFN-γ，且IFN-γ+Tim-3+NK細胞百分比隨PMA濃度增大無變化。
　　結論：
　　1、HIV感染者總NK細胞、CD56dimNK及CD56-CD16+NK細胞的Tim-3百分數低于正常對照。
　　2、HIV感染者NK細胞分泌IFN-γ能