檢測4種手部非結(jié)核分枝桿菌感染的多重PCR方法的建立.pdf

1、目的：建立一種特異、敏感、快速的檢測海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌的雙重PCR和胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌的三重PCR方法，為臨床快速鑒定手部非結(jié)核分枝桿菌感染的早診斷、早治療提供檢測方法。
　　方法：在GeneBank數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)中分別查找出海分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌4種手部常見NTM的特異基因序列，根據(jù)上述四種細(xì)菌的特異基因序列用 NCBI/Primer-BLAST軟件系統(tǒng)設(shè)計(jì)各自引物序列，并用M

2、FEPrimer-2.0軟件篩選出特異的、相互間無互補(bǔ)或互補(bǔ)配對(duì)較少的引物分別構(gòu)建海、潰瘍分枝桿菌的雙重PCR和胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌3種NTM的三重PCR。將從菌種庫購買的海分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌4種標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)后將菌落移至無菌的營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)1～2天進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)菌DNA的提取。用海、潰瘍、胞內(nèi)、龜分枝桿菌的DNA與相應(yīng)細(xì)菌的引物進(jìn)行單重 PCR擴(kuò)增驗(yàn)證引物的特異性，再用海分枝桿菌的

3、引物、潰瘍分枝桿菌的引物分別和海、潰瘍分枝桿菌的DNA擴(kuò)增驗(yàn)證雙重PCR的特異性，同理，用胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌的特異性引物和胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌的DNA擴(kuò)增驗(yàn)證三重PCR的特異性。同時(shí)，根據(jù)雙重PCR、三重PCR各自的引物的退火溫度，摸索最佳退火溫度，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。將構(gòu)建的兩個(gè)多重PCR用于14例考慮手部NTM感染標(biāo)本的檢測。
　　結(jié)果：
　　1.用成功構(gòu)建的兩個(gè)多重PCR檢測14例臨床手

4、部考慮NTM感染標(biāo)本，檢出率為93％；
　　2.海、潰瘍分枝桿菌的雙重PCR、胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌的三重 PCR最佳退火溫度分別是57.5℃、58.6℃；
　　3.兩個(gè)多重 PCR檢測臨床手部NTM感染標(biāo)本的時(shí)間大約是6小時(shí)，較傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室鑒定NTM時(shí)間短。
　　結(jié)論：本研究構(gòu)建的兩個(gè)多重PCR可鑒定引起手部感染的海分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌的常見NTM，可早期、快速、可靠的檢測出