枯草芽孢桿菌pgsA與豬傳染性胃腸炎病毒Sa融合基因的原核表達.pdf

1、1.根據(jù)GenBank中已發(fā)表的枯草芽孢桿菌pgsA基因序列，設(shè)計合成了一對能擴增1155bp基因片段的引物，引物兩端分別有KpnⅠ和BamHⅠ的酶切位點。以枯草芽孢桿菌染色體DNA為模板，經(jīng)PCR擴增得到目的片段，然后將其克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)藍白斑篩選和酶切鑒定選擇陽性克隆進行序列測定，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-pgsA。用DNAstar軟件將其與GenBank上的pgsA序列進行同源性比較，結(jié)果表明核苷酸同源

2、性在90％以上，氨基酸同源性94％以上。核苷酸序列系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)該試驗株與浙江株親緣關(guān)系最近。經(jīng)ProtScale軟件分析表明:該基因所編碼蛋白在靠近其N端存在一個跨膜區(qū)，為跨膜表達體系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　 2.將豬傳染性胃腸炎病毒接種ST細胞進行增殖，待細胞出現(xiàn)明顯的病變后，將細胞反復(fù)凍融三次收獲病毒。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒S基因的序列，設(shè)計合成了一對擴增S基

3、因包含A抗原位點724bp基因片段(Sa)的引物，引物兩端分別有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點。以感染細胞提取的病毒RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴增得到目的片段，然后將其克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)藍白斑篩選和酶切鑒定選擇陽性克隆進行序列測定，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-Sa。用DNAstar軟件將其與GenBank上的序列進行同源性比較，結(jié)果表明核苷酸同源性為97％以上，氨基酸同源性為93％以上。根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒

4、Sa基因核苷酸序列繪制的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明，試驗株與TH-98株親緣性最近。
　　 3.對克隆載體pMD18-T-pgsA做KpnⅠ和BamHⅠ的雙酶切，將所得片段插入表達載體pET-32a(+)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-pgsA，對克隆載體pMD18-T-Sa和重組質(zhì)粒pET-pgsA分別做BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，將Sa片段插入到pET-pgsA中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-pgsA-Sa。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定為陽性后，