局部碳酸酐酶抑制劑（派立明）對(duì)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)觀察.pdf

1、目的：觀察局部碳酸酐酶抑制劑(派立明)對(duì)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的影響，以評(píng)價(jià)派立明眼液是否影響角膜內(nèi)皮。 方法：實(shí)驗(yàn)選擇健康日本大耳白兔24只(瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重均在2.5～3.0Kg，雌雄不限。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于同一條件的單獨(dú)籠子中，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程食物、水源供給充分。實(shí)驗(yàn)前對(duì)每只實(shí)驗(yàn)用兔雙眼行裂隙燈顯微鏡檢查、非接觸性角膜內(nèi)皮顯微鏡測(cè)量角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度、Schiotz眼壓計(jì)測(cè)量眼壓、超聲波角膜厚度測(cè)量?jī)x測(cè)量角膜厚度。將上述各項(xiàng)

2、指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)的動(dòng)物隨機(jī)分成2組，每組12只，藥物作用時(shí)間點(diǎn)選擇為每日8點(diǎn)、14點(diǎn)和20點(diǎn)。第一組的右眼滴用1％派立明，設(shè)為派立明組；左眼滴用0.9％生理鹽水，設(shè)為派立明對(duì)照眼。第二組的右眼滴用相同劑量防腐劑0.05％苯扎氯胺(Benzalconium Chloride)，設(shè)為防腐劑組；左眼滴用0.9％生理鹽水，設(shè)為防腐劑對(duì)照組。分別于用藥后2周、4周和8周隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)用兔，每組各4只，分別行雙眼裂隙燈顯微鏡檢查，并測(cè)量角膜內(nèi)皮細(xì)胞

3、密度、眼壓及角膜厚度。1％戊巴比妥鈉溶液(3ml/Kg)耳緣靜脈注射實(shí)施全身麻醉后，取雙側(cè)帶有角膜緣外1mm鞏膜的角膜。取每只角膜的1/2(同一部位)用臺(tái)盼藍(lán)和茜素紅聯(lián)合染色法染色：自行現(xiàn)配0.25％臺(tái)盼藍(lán)染液和0.2％茜素紅染液，在角膜片內(nèi)皮面上滴加0.25％臺(tái)盼藍(lán)染色液至完全覆蓋角膜，90秒后BSS輕柔沖洗去除染色液，用濾紙吸去多余的BSS，再經(jīng)0.2％茜素紅染色90秒，BSS輕柔沖洗去除染色液。置于倒置像差顯微鏡下觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞

4、形態(tài)的變化。根據(jù)活細(xì)胞不著色且細(xì)胞間質(zhì)被紅染，而死細(xì)胞其核被藍(lán)染的特性，計(jì)數(shù)100個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞中核著色的細(xì)胞個(gè)數(shù)，即可得到內(nèi)皮細(xì)胞的活性率(100-核著色的細(xì)胞數(shù)/100*100％)，采用顯微鏡計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)死亡細(xì)胞，每張切片在角膜中央?yún)^(qū)隨機(jī)選取5個(gè)非重復(fù)視野計(jì)數(shù)，計(jì)算其活性內(nèi)皮細(xì)胞的平均百分率。取部分剩余角膜(2×2mm2)，立即用4％戊二醛，鋨酸溶液固定并標(biāo)記，乙醇、丙酮脫水，包埋后超薄切片，行透射電鏡檢查并照相。剩余的角膜組織于10％福

5、爾馬林中固定并標(biāo)記，行病理組織學(xué)檢查并照相。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： (1)裂隙燈檢查：實(shí)驗(yàn)后第2周、4周和8周派立明組角膜透明、未見明顯變化。滴用派立明眼液各組球結(jié)膜可出現(xiàn)—過(guò)性充血，無(wú)水腫及分泌物增多，無(wú)角膜混濁及角膜潰瘍，無(wú)前房炎癥反應(yīng)，未見晶狀體混濁。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中派立明組與防腐劑組各有1只兔眼結(jié)膜

6、彌漫性充血，以下方瞼球結(jié)膜明顯，未見濾泡增生，結(jié)膜囊見少量粘液狀分泌物，角膜透明、上皮完整，未見點(diǎn)狀缺損。至用藥后4-8周該現(xiàn)象仍持續(xù)存在，但不加重。 (2)眼壓測(cè)量結(jié)果：實(shí)驗(yàn)前派立明組眼壓為12.74±3.12mmHg：實(shí)驗(yàn)8周后眼壓為11.23±2.13mmHg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。派立明對(duì)照組眼壓12.68±2.61mmHg，8周后眼壓為12.13±4.10 mmHg，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)顯著性(P>0.05)。派立明對(duì)照組眼

7、壓稍有降低，但下降值明顯低于派立明組，兩組的差異有顯著性(P<0.05)。 (3)角膜厚度測(cè)量：實(shí)驗(yàn)前派立明組和派立明對(duì)照組兔角膜厚度分別為59.17±21.35um，359.17±20.65um，于用藥后2周派立明組和派立明對(duì)照組兔角膜厚度分別為369.5±18.48um，370.75±29.70um；4周時(shí)兩組兔角膜厚度分別為377.25±31.19um，370.88±28.40um；8周時(shí)兩組角膜厚度分別是390.75±1

8、5.65um，418.50±14.27um，每個(gè)時(shí)間段派立明組與派立明對(duì)照組的角膜厚度相比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)前防腐劑組角膜厚度361.08±32.25um，用藥后2周、4周及8周后角膜厚度分別是370.75±29.70 um，370.88±28.40 um，418.50±14.27 um。每組數(shù)值與相應(yīng)時(shí)間的派立明組的數(shù)值相比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。各時(shí)間點(diǎn)各組角膜厚度與實(shí)驗(yàn)前的

9、相應(yīng)數(shù)值比較均無(wú)明顯差異(P>0.05)。 (4)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度觀察結(jié)果：派立明組與防腐劑組角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度實(shí)驗(yàn)前分別為3229.17±457.99個(gè)/mm2，3062.50±555.19個(gè)/mm2，2周時(shí)兩組分別為2833.33±288.68個(gè)/mm2，2800.00±354.19個(gè)/mm2；第4周時(shí)兩組的內(nèi)皮細(xì)胞密度分別為2906.25±325.62個(gè)/mm2，2781.25±339.05個(gè)/mm2；至8周時(shí)派立明組與防腐

10、劑組數(shù)值分別為2812.50±473.24個(gè)/mm2，2375.00±250.00個(gè)/mm2，以上各時(shí)間點(diǎn)兩組內(nèi)皮細(xì)胞密度均無(wú)明顯差異，與實(shí)驗(yàn)前的相應(yīng)數(shù)值比較均無(wú)明顯差異(P>0.05)。 (5)角膜內(nèi)皮細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)和茜素紅聯(lián)合染色法觀察細(xì)胞活性并計(jì)算細(xì)胞活性率：實(shí)驗(yàn)后第2周、4周及8周角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，見少數(shù)細(xì)胞質(zhì)紅染，細(xì)胞核藍(lán)染，未見細(xì)胞脫落。實(shí)驗(yàn)后2周時(shí)派立明組角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性率為99.51±0.04％，防腐劑組為

11、99.29±0.20％；實(shí)驗(yàn)后4周時(shí)派立明組和防腐劑組的內(nèi)皮細(xì)胞活性率分別為99.45±0.08％,99.10±0.15％：實(shí)驗(yàn)后8周時(shí)派立明組和防腐劑組相應(yīng)數(shù)值分別為99.36±0.06％，99.33±0.13％，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，以上時(shí)間點(diǎn)派立明組與防腐劑組內(nèi)皮活性率差別亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。派立明對(duì)照組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值分別為：99.54±0.03％、99.37±0.15％和99.40±0.13％，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的派立明組的數(shù)值

12、相比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 (6)光學(xué)顯微鏡觀察：派立明組于用藥后第2周、4周及8周角膜組織內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)明顯變化，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，連接緊密，未見內(nèi)皮細(xì)胞多層樣變化。同一時(shí)間點(diǎn)派立明組與防腐劑組角膜相比，各組角膜基質(zhì)層均未見增厚，膠原纖維排列緊密，其間無(wú)水腫液。 (7)透射電鏡觀察：派立明組和防腐劑組角膜內(nèi)皮細(xì)胞均未發(fā)生顯著病理性改變，細(xì)胞呈六邊形鑲嵌型排列，細(xì)胞膜透明、完整，核膜完整，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見線粒體腫