EphA2經(jīng)P-gp及自噬作用調(diào)控鼻咽癌紫杉醇耐藥性.pdf

1、目的:鼻咽癌紫杉醇耐藥性的形成是一復(fù)雜調(diào)控機(jī)制，鑒于經(jīng)典耐藥理論中P-gp蛋白發(fā)揮的重要作用以及近年來自噬作用在腫瘤化療耐藥領(lǐng)域的新興熱點(diǎn)地位，本研究在發(fā)現(xiàn)EphA2可對(duì)鼻咽癌細(xì)胞紫杉醇耐藥性起調(diào)控作用的前期研究基礎(chǔ)上，旨在進(jìn)一步探討EphA2調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞紫杉醇耐藥性的P-gp相關(guān)及自噬相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:1.利用Western Blot分別檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞中慢病毒介導(dǎo)的EphA2沉默及過表達(dá)組與陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無義shRN

2、A或無義cDNA)和空白對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體）內(nèi)P-gp蛋白的表達(dá)情況，探討EphA2是否具有調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞P-gp表達(dá)的能力;
　　2.利用siRNA干擾技術(shù)在鼻咽癌細(xì)胞中下調(diào)P-gp的表達(dá)，同時(shí)給予空白對(duì)照組（原始細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染無義序列）和P-gp表達(dá)下調(diào)組0.1nM/L的紫杉醇（該濃度為前期研究所得的原始細(xì)胞的IC30濃度，結(jié)合文獻(xiàn)，考慮到P-gp表達(dá)下調(diào)后的紫杉醇增敏作用，故選擇該濃度）刺激，48小時(shí)后CCK-8法

3、檢測(cè)吸光度，得到各組的存活率，以說明P-gp蛋白的表達(dá)改變是否影響鼻咽癌細(xì)胞的紫杉醇耐藥行為;
　　3.利用siRNA干擾技術(shù)在EphA2過表達(dá)鼻咽癌細(xì)胞中下調(diào)P-gp的表達(dá)，同時(shí)給予空白對(duì)照組（EphA2過表達(dá)細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（EphA2過表達(dá)并轉(zhuǎn)染無義序列細(xì)胞）和P-gp表達(dá)下調(diào)組(EphA2過表達(dá)并P-gp表達(dá)下調(diào)細(xì)胞)5nM/L的紫杉醇（前期研究基礎(chǔ)中該濃度下實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存活率差異最大）刺激，48小時(shí)后CCK-8法檢測(cè)

4、吸光度，得到各組的存活率，以探討在EphA2過表達(dá)細(xì)胞中，調(diào)控P-gp表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞紫杉醇耐藥性的影響;
　　4.鑒于文獻(xiàn)報(bào)道PI3-K/Akt通路參與P-gp蛋白表達(dá)調(diào)控以及前期研究發(fā)現(xiàn)EphA2通過PI3-K/Akt通路影響鼻咽癌紫杉醇耐藥性，本研究在EphA2過表達(dá)鼻咽癌細(xì)胞中，分別加入0nM/L和20nM/L的PI3-K/Akt抑制劑LY294002，再給予5nM/L的紫杉醇刺激，48小時(shí)后利用Western Blot檢

5、測(cè)各組PI3-K/Akt信號(hào)通路蛋白Akt和p-Akt，以及P-gp的表達(dá)水平，以探討在EphA2過表達(dá)細(xì)胞中，PI3-K/Akt通路是否參與P-gp蛋白的表達(dá)調(diào)控;
　　5.給予實(shí)驗(yàn)組（EphA2過表達(dá)鼻咽癌細(xì)胞）及對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無義cDNA)5nM/L紫杉醇刺激，48小時(shí)后利用Western Blot檢測(cè)自噬標(biāo)志性LC3B-Ⅱ蛋白在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中的表達(dá)差異，初步探討EphA2調(diào)控鼻咽癌紫杉醇耐藥性的可能機(jī)制（自噬作用）。

6、>　　結(jié)果:1.EphA2沉默組中P-gp蛋白較兩對(duì)照組表達(dá)下調(diào)，EphA2過表達(dá)組中P-gp蛋白較兩對(duì)照組表達(dá)上調(diào);
　　2.紫杉醇作用于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和P-gp表達(dá)下調(diào)組的存活率分別是68.9±4.0％，72.4±6.2％ v.s.52.1±3.7％，P-gp表達(dá)下調(diào)組對(duì)紫杉醇的耐藥性較兩對(duì)照組降低(P＜0.05);
　　3.在EphA2過表達(dá)鼻咽癌細(xì)胞中，紫杉醇作用于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和P-gp表達(dá)下調(diào)組的

7、存活率分別是57.9±6.2％，58.2±5.8％ v.s.36.1±5.1％，P-gp表達(dá)下調(diào)組對(duì)紫杉醇的耐藥性較兩對(duì)照組降低(P＜0.05);
　　4.在EphA2過表達(dá)鼻咽癌細(xì)胞中，給予通路抑制劑組較對(duì)照組Akt表達(dá)基本不變，而磷酸化的Akt表達(dá)下降，P-gp表達(dá)下降;
　　5.EphA2過表達(dá)鼻咽癌細(xì)胞株中自噬標(biāo)志性LC3B-Ⅱ蛋白的表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)。
　　結(jié)論:1.EphA2具有調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞P-gp表達(dá)

8、的能力;
　　2.下調(diào)P-gp蛋白表達(dá)可降低鼻咽癌細(xì)胞紫杉醇耐藥性;
　　3.下調(diào)P-gp蛋白表達(dá)可逆轉(zhuǎn)EphA2介導(dǎo)的鼻咽癌紫杉醇耐藥性;
　　4.在EphA2過表達(dá)細(xì)胞中，PI3-K/Akt通路參與P-gp蛋白的表達(dá)調(diào)控;
　　5.在經(jīng)紫杉醇作用的鼻咽癌細(xì)胞中，EphA2表達(dá)的改變能影響自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，提示EphA2也可能經(jīng)自噬途徑調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的紫杉醇耐藥性。
　　綜上所述，EphA2可通過介