EphA2及其S897位點(diǎn)磷酸化在鼻咽癌生長(zhǎng)和遷移中的作用.pdf

1、目的：EphA2是Eph(Erythropoietin-producing hepatoma cell line,Eph)受體酪氨酸激酶家族的成員，具有介導(dǎo)生長(zhǎng)因子促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的作用。我們前期的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，EphA2表達(dá)水平及其EphA2 S897位點(diǎn)的磷酸化水平在高轉(zhuǎn)移5-8F鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)細(xì)胞中上調(diào)。本課題研究EphA2表達(dá)水平及其S897位點(diǎn)的磷酸化水平對(duì)鼻咽癌

2、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分布和細(xì)胞遷移能力的影響，并探討EGFR是否通過(guò)激活PI3K-AKT使EphA2S897位點(diǎn)磷酸化，為揭示EphA2在NPC發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：⑴Western blotting檢測(cè)高轉(zhuǎn)移的NPC細(xì)胞株5-8F細(xì)胞和低轉(zhuǎn)移的NPC細(xì)胞株6-10B細(xì)胞中EphA2表達(dá)水平及其EphA2 S897位點(diǎn)的磷酸化水平，以及EGFR表達(dá)水平和磷酸化EGFR的水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩株細(xì)胞中

3、EphA2配體EphrinA1的mRNA表達(dá)水平；⑵Western blotting結(jié)合小分子激酶抑制劑檢測(cè)EGFR是否通過(guò)激活PI3K-AKT使EphA2S897位點(diǎn)磷酸化；⑶脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將突變型EphA2(S897A)表達(dá)載體和空載體轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞，將野生型EphA2表達(dá)載體和空載體分別轉(zhuǎn)染6-10B細(xì)胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；⑷以突變型EphA2高表達(dá)的5-8F細(xì)胞系、野生型EphA2高表達(dá)的6-10B細(xì)胞系及其空白載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

4、為樣本，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移。
　　結(jié)果：①5-8F細(xì)胞EphA2的表達(dá)水平和EphA2 S897位點(diǎn)的磷酸化水平以及EGFR的表達(dá)水平和磷酸化EGFR的水平明顯高于6-10B細(xì)胞，證實(shí)了我們前期的定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果；②EphA2配體Ephrin Al mRNA在5-8F細(xì)胞的表達(dá)水平低于6-10B細(xì)胞；③在5-8F細(xì)胞和6-10B細(xì)胞中，EGFR通過(guò)激活PI3K-AKT

5、使EphA2 S897位點(diǎn)磷酸化；④建立了突變型EphA2高表達(dá)的5-8F細(xì)胞系，野生型EphA2高表達(dá)的6-10B細(xì)胞系及其空白載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；⑤與空載體轉(zhuǎn)染的5-8F細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞比較，突變型EphA2高表達(dá)的5-8F細(xì)胞的增殖能力降低，G0/G1細(xì)胞增加，而S期細(xì)胞減少，細(xì)胞遷移能力降低;與空載體轉(zhuǎn)染的6-10B細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染6-10B細(xì)胞比較，野生型EphA2高表達(dá)的6-10B細(xì)胞增殖能力增加，S期細(xì)胞增加，而G2/M期

6、細(xì)胞減少，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。
　　結(jié)論：⑴高轉(zhuǎn)移5-8F NPC細(xì)胞的EphA2表達(dá)水平及其S897位點(diǎn)的磷酸化水平顯著高于低轉(zhuǎn)移的6-10B NPC細(xì)胞，而Ephrin A1的表達(dá)水平顯著低于6-10B NPC細(xì)胞；⑵EGFR通過(guò)激活PI3K-AKT信號(hào)通路使NPC細(xì)胞EphA2S897位點(diǎn)磷酸化；⑶建立了突變型EphA2高表達(dá)的5-8F細(xì)胞系和野生型EphA2高表達(dá)的6-10B細(xì)胞系；⑷EphA2高表達(dá)及其S897位點(diǎn)的磷酸化