BDNF-TrKB對人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226表達(dá)和分泌VEGF的調(diào)控作用.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　第一部分 外源性BDNF對RPMI8226細(xì)胞表達(dá)和分泌VEGF的上調(diào)作用
　　背景和目的:血管新生參與多發(fā)性骨髓瘤(MM)的病理生理過程,與MM的發(fā)生及預(yù)后關(guān)系密切。骨髓瘤細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞可分泌多種促血管新生因子,如VEGF, IL-6等均在骨髓瘤血管新生中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MM中存在著腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)異常高表達(dá),而且MM患者血清BDNF表達(dá)水平和一種重要的促血管新

2、生因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)平行并存在相關(guān)性。目前大量資料證實多種血管內(nèi)皮細(xì)胞及新生的血管平滑肌細(xì)胞均可表達(dá)和分泌BDNF,推測BDNF在一定程度上參與了機(jī)體新生血管的形成。本研究對外源性BDNF誘導(dǎo)人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(HMCLs)RPMI8226表達(dá)和分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)進(jìn)行了初步探討,為BDNF參與MM血管新生及對其他促血管新生因子的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。
　　方法:給予不同濃度的外源性BDNF(0、50

3、、100、200、400ng/ml)誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞24、48、72h,采用RT-PCR法和ELISA法分別在mRNA水平和蛋白水平檢測BDNF誘導(dǎo)前后RPMI8226細(xì)胞中VEGF表達(dá)和分泌水平的變化。
　　結(jié)果:RPMI8226細(xì)胞表達(dá)和分泌三種亞型VEGF:VEGF121、VEGF145和VEGF165。外源性BDNF以時間-劑量依賴性方式促進(jìn)VEGF的表達(dá)和分泌。100~200ng/ml BDNF作用48-72h即

4、可有效上調(diào)VEGF表達(dá)和分泌。
　　結(jié)論:外源性BDNF具有顯著的上調(diào)VEGF的作用,可能通過此途徑參與MM的血管新生病理過程。
　　第二部分 阻斷BDNF/TrkB通路對RPMI8226細(xì)胞表達(dá)和分泌VEGF的下調(diào)作用
　　背景和目的:多發(fā)性骨髓瘤(MM)中存在著腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及其高親和力酪氨酸激酶受體TrkB的異常表達(dá),近年來研究發(fā)現(xiàn)BDNF/TrkB在調(diào)控細(xì)胞增殖、生長、遷移、侵襲和腫瘤血管新生過

5、程中起重要作用,參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究初步探討了BDNF/TrkB信號通路調(diào)控RPMI8226細(xì)胞表達(dá)和分泌VEGF的重要作用,旨在說明該信號通路與MM血管新生的密切關(guān)系。
　　方法:采用RT-PCR法和ELISA法分別在mRNA水平和蛋白水平檢測BDNF(100ng/ml)及其受體TrkB酪氨酸激酶信號通路阻斷劑K252α(100、200、300、400、500nmol/L)作用72h前后RPMI8226細(xì)胞中VEG

6、F表達(dá)和分泌水平的變化。設(shè)計和構(gòu)建針對人BDNF基因的siRNA真核表達(dá)載體,經(jīng)酶切鑒定和DNA序列分析鑒定后用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染,將空載體質(zhì)粒pGenesil-1和重組質(zhì)粒pGenesil-shRNA-BDNF分別轉(zhuǎn)染入RPMI8226細(xì)胞(依次命名為P0組、P1組);采用RT-PCR法和Western-blot法分別從mRNA水平和蛋白水平檢測BDNF表達(dá)水平的變化;MTT法檢測細(xì)胞的增殖活性;RT

7、-PCR法檢測shBDNF對RPMI8226細(xì)胞表達(dá)VEGF的影響。
　　結(jié)果:(1)K252α對外源性BDNF的阻斷作用呈劑量依賴性;(2)成功構(gòu)建了針對BDNF的siRNA真核表達(dá)載體。P1組與空白組相比,BDNF mRNA水平下調(diào)(38.41±14.79)％,BDNF蛋白水平下調(diào)(30.43±3.86)%(P<0.05);(3)MTT實驗發(fā)現(xiàn)空白組、P0組、P1組細(xì)胞的增殖活性分別為(0.56±0.06)、(0.50±0.0

8、4)和(0.42±0.06)。P1組細(xì)胞的增殖活性明顯低于空白組和P0組(P<0.05);(4)干擾內(nèi)源性BDNF的表達(dá)可顯著下調(diào)VEGF的表達(dá)水平,P1組的VEGF121、VEGF145和VEGF165 mRNA表達(dá)量分別為空白組的(0.62±0.07)倍、(0.47±0.09)倍和(0.57±0.02)倍(P<0.05)。
　　結(jié)論:BDNF存在自分泌及旁分泌兩種作用方式。BDNF可能通過激活TrkB酪氨酸激酶信號通路而參與調(diào)