肝X受體激動(dòng)劑TO901317對(duì)小鼠順鉑所致腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、急性腎損傷是一組由多種病因?qū)е碌?、以短時(shí)間內(nèi)血肌酐顯著上升為共同特點(diǎn)的臨床綜合征，是一種臨床常見的急、危、重癥，腎毒性藥物所致的急性腎損傷是其中較常見的一類。臨床常用的抗腫瘤藥、免疫抑制劑、抗生素等都有引起急性腎損傷的風(fēng)險(xiǎn)，其中抗腫瘤藥物順鉑的腎毒性是較常見和嚴(yán)重的。
　　順鉑(Cisplatin)，化學(xué)名為順式-二氯二氨合鉑(cis-dischlorodiammine-platinum，CDDP)，是金屬鉑類絡(luò)合物的一種，因其阻

2、止DNA復(fù)制并影響RNA和蛋白質(zhì)的合成，具有抗腫瘤作用強(qiáng)、抗瘤譜廣的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于多種實(shí)體腫瘤的治療中。順鉑的治療作用呈劑量依賴性，其給藥后在腎臟組織中濃度最高，累積毒性可導(dǎo)致患者出現(xiàn)急性腎衰竭等嚴(yán)重后果，有報(bào)道順鉑造成的腎毒性約25％發(fā)展為急性腎衰竭，大大限制了其在臨床大劑量和長(zhǎng)期的應(yīng)用。近年研究表明，順鉑通過參與氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)等復(fù)雜分子過程，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡與壞死。目前，臨床尚無有效防治順鉑腎毒性的方法，因此，如何減輕

3、或預(yù)防順鉑所致的腎損傷具有十分重要的臨床意義和價(jià)值。
　　肝X受體(Liver X receptors，LXRs)作為配體依賴性核受體超家族成員之一，是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，分為α（主要表達(dá)于肝、脂肪組織、腎、小腸和巨噬細(xì)胞）和β（廣泛表達(dá)）兩種亞型。LXRs廣泛參與脂質(zhì)代謝，并在炎癥反應(yīng)的調(diào)控和固有免疫中發(fā)揮重要作用。近年來LXRs與炎癥反應(yīng)的關(guān)系是研究熱點(diǎn)，TO901317是人工合成的LXRs激動(dòng)劑，能同時(shí)激活α和β兩種受體類型，

4、體外實(shí)驗(yàn)證明肝X受體激活后可減少IL-6、COX-2等炎癥介質(zhì)的釋放，負(fù)性調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，并明顯降低脂多糖LPS介導(dǎo)的TNF-α及PGE2的產(chǎn)生;在人腎小管上皮細(xì)胞系（HK-2）中，脂多糖抑制肝X受體mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá);在高糖動(dòng)物模型中，LXR激動(dòng)劑可通過抑制過氧化發(fā)揮保護(hù)作用。
　　目前，肝X受體在腎臟中的生物作用尚不十分明確，LXRs激活后能否對(duì)急性腎損傷發(fā)揮保護(hù)作用？TO901317如何在順鉑所致腎損傷中發(fā)揮作用？為解答以

5、上問題，同時(shí)為開發(fā)臨床腎臟保護(hù)藥物提供更多依據(jù)，我們復(fù)制順鉑腎損害模型，設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)。
　　目的：
　　1.構(gòu)建順鉑性腎損傷小鼠模型;
　　2.觀察TO901317激活肝X受體后是否對(duì)順鉑性腎損傷小鼠發(fā)揮腎臟保護(hù)作用;
　　3.研究TO901317對(duì)順鉑性腎損傷小鼠的腎臟保護(hù)作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.順鉑性腎損傷小鼠模型構(gòu)建
　　8-10周齡雄性C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，40只

6、小鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組、順鉑組、順鉑+TO901317組、TO901317組。順鉑組和順鉑+TO901317組小鼠均給予一次性腹腔注射順鉑20mg/Kg（以生理鹽水溶解，配置成2mg/ml順鉑溶液），對(duì)照組小鼠注射等量生理鹽水。12小時(shí)后，順鉑+TO901317組小鼠給予TO901317灌胃3天（10mg/Kg/天），TO901317組用等量TO901317灌胃，順鉑組小鼠則用TO901317的有機(jī)溶劑——二甲基亞砜(DMSO)灌胃。

7、注射順鉑3天后，處死小鼠，采集下腔靜脈血并分離腎臟組織。
　　2.腎功能測(cè)定
　　用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血漿尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)。
　　3.腎臟組織學(xué)檢測(cè)
　　小鼠腎臟經(jīng)多聚甲醛固定、石蠟包埋并切片后，分別行HE染色和PAS染色，鏡下觀察腎組織損傷情況，依腎小管損傷百分比進(jìn)行組織損傷分級(jí):0，無損傷;1級(jí)，＜25％;2級(jí)，25-50％;3級(jí)，50-75％;4級(jí)，＞75％。
　　4.實(shí)

8、時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)
　　提取腎組織mRNA，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)GAPDH、LXR、LXRβ、ABCA1、ABCG1、TNF-α、IL-1β、P47phox、gp91pbox、COX-2、MCP-1及ICAM-1的表達(dá)水平。
　　5.Western Blot檢測(cè)
　　提取腎組織蛋白，Western Blot檢測(cè)TNF-α、P47phox、gp91phox及COX-2的蛋白表達(dá)水平。
　　6.腎PGE2

9、含量測(cè)定
　　用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)腎組織內(nèi)PGE2含量。
　　7.硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(TBARS)檢測(cè)
　　ELISA試劑盒檢測(cè)腎臟硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(TBARS)。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，組間均數(shù)的比較采用方差齊性檢驗(yàn)與單因素方差分析，定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠的一般情況
　　與

10、對(duì)照組相比，腹腔一次性注射順鉑3天后，小鼠狀態(tài)較差，進(jìn)食、活動(dòng)等明顯減少，嗜睡，擁擠在一起，精神萎靡，毛發(fā)灰暗無光澤。各組小鼠自順鉑注射后體重變化不明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著。
　　2.TO901317對(duì)LXRs目標(biāo)基因的影響
　　ABAC1和ABCG1是評(píng)價(jià)肝X受體活化的目標(biāo)基因。順鉑+TO901317組和TO901317組ABAC1及ABCG1mRNA水平都明顯升高(P＜0.01)。
　　3.TO901317減輕順鉑

11、所致腎功能不全
　　與正常對(duì)照組小鼠相比，順鉑組小鼠的血尿素氮升高約4.5倍，肌酐升高約4倍(P＜0.05)。TO901317可明顯減輕順鉑誘導(dǎo)的腎功能不全(P＜0.05)。
　　4.TO901317減輕順鉑所致的腎臟組織學(xué)變化
　　順鉑組小鼠腎臟產(chǎn)生顯著的病理變化，如:腎小管擴(kuò)張、小管壞死、蛋白管型、腎小管上皮細(xì)胞脫落，TO901317能明顯減輕這些組織學(xué)改變。組織病理半定量分析中，順鉑+TO901317組的組織損傷

12、指數(shù)明顯低于順鉑組(P＜0.01)。
　　5.TO901317減輕順鉑介導(dǎo)的腎臟炎癥反應(yīng)
　　與正常對(duì)照組相比，順鉑組腎臟TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)水平分別升高了4.7倍和4.5倍，外周血的TNF-α水平升高6.9倍(P＜0.05)，而順鉑+TO901317組TNF-α的表達(dá)水平明顯降低。同樣，順鉑上調(diào)腎臟IL-1β、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的mRNA水平，TO901317能抑制這些變化。故TO90131

13、7處理能降低炎癥因子、趨化因子和粘附因子的表達(dá)，減輕順鉑介導(dǎo)的腎臟炎癥反應(yīng)。
　　6.TO901317減輕順鉑介導(dǎo)的腎臟氧化應(yīng)激
　　順鉑組腎臟P47phox和gp91phoxmRNA水平較正常組分別高5.6倍和4.4倍(P＜0.05)，TO901317可顯著降低其高表達(dá)。TBARS水平的變化及TO901317的治療效果與P47phox和gp91phox結(jié)果一致。
　　7.TO901317減輕順鉑所致的腎臟COX-2過

14、表達(dá)
　　與對(duì)照組相比，順鉑誘導(dǎo)COX-2mRNA和蛋白表達(dá)分別增高9倍、13倍(P＜0.01)，而TO901317可分別下調(diào)其表達(dá)至2.6倍及4.6倍。另外，順鉑可誘導(dǎo)mPGES-1表達(dá)升高、PGE2生成增多，而TO901317治療可明顯降低mPGES-1的高表達(dá)，使PGE2生成減少。
　　結(jié)論：
　　1.肝X受體激動(dòng)劑TO901317可明顯改善順鉑誘導(dǎo)的腎功能不全及腎臟病理改變。
　　2.初步探討TO9013