Egr-1反義寡核苷酸對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、2000年,Yan, S. F.等首先在《Nature Medicine》報(bào)道,Egr-1基因的激活在組織I/R損傷的發(fā)病機(jī)理中起主導(dǎo)作用。敲除Egr-1基因,能夠明顯減輕小鼠肺I/R損傷,保護(hù)肺功能。此后許多研究結(jié)果證實(shí)抑制Egr-1基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)可以明顯減少組織I/R時(shí)炎性細(xì)胞的浸潤與活化,改善器官功能。本課題組以往研究結(jié)果證實(shí)碘化-N-正丁基氟哌啶醇(F2)有保護(hù)心肌I/R損傷的作用,其機(jī)制可能與抑制心肌組織Egr-1的表達(dá)有關(guān)

2、。為確認(rèn)Egr-1在心肌I/R損傷發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用,本實(shí)驗(yàn)采用大鼠心肌I/R模型,通過Egr-1 AS-ODN抑制大鼠心肌組織Egr-1蛋白的表達(dá),從心肌組織炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及心臟血流動力學(xué)、心肌酶釋放等角度觀察其對心肌I/R損傷的作用。
　　一.實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.給大鼠靜脈注射5′-FITC標(biāo)記的Egr-1 AS-ODN(4 mg/kg),24 h后,斷頭處死大鼠,取出心臟作常規(guī)冷凍切片。熒光顯微鏡400

3、倍視野下,用488 nm激發(fā)光照射,觀察心肌組織對5′-FITC標(biāo)記的Egr-1 AS-ODN的攝取,并拍攝照片。
　　2.大鼠隨機(jī)分成5組:Sham(假手術(shù))組、I/R(缺血再灌注)組、S(Egr-1正義寡核苷酸)組、Sc(錯(cuò)配寡核苷酸)組、AS(Egr-1反義寡核苷酸)組。缺血前24 h靜脈注射給藥。24 h后,制作大鼠心肌I/R模型:手術(shù)結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支(LAD)造成心肌缺血60 min,然后解除結(jié)扎再灌注180 m

4、in。并同步監(jiān)測血流動力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo):HR、SP、AP、LVSP、左心室內(nèi)壓變化速率最大值(±dp/dtmax)的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取結(jié)扎線下缺血心肌組織,用Western-blot方法檢測心肌組織Egr-1蛋白表達(dá)的變化,用相應(yīng)測試盒檢測心肌組織中MPO、SOD活力及MDA含量的變化,同時(shí)頸動脈取血2 ml,離心取血清,用相應(yīng)測試盒檢測血清CK、LDH活力的變化。
　　二.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.5′-FITC標(biāo)記的

5、Egr-1 AS-ODN可被心肌組織攝取。
　　2.心肌組織Egr-1蛋白的表達(dá):與Sham組相比,I/R組、S組、Sc組的蛋白表達(dá)分別增高4.41倍、4.00倍及4.14倍,差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而I/R組、S組、Sc組的蛋白表達(dá)差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與I/R組相比,AS組蛋白表達(dá)明顯下降,抑制率達(dá)58.53％,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.炎性反應(yīng)與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)指標(biāo)檢測:與Sham組相比,I/R組的MPO活力增高2.17倍

6、,SOD活力下降47.97%,MDA含量增高1.44倍,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與I/R組相比, AS組能使MPO活力下降38.46%,使SOD活力增高31.91%,使MDA含量下降44.26%,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。I/R組、S組、Sc組的MPO活力、SOD活力及MDA含量差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.血流動力學(xué)監(jiān)測:缺血末期,I/R組的HR、SP、AP、LVSP和±dp/dt max值均降低,再灌注末期,I/RHR、SP、AP、LVSP

7、和±dp/dt max值進(jìn)一步降低,與Sham組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AS組的HR、AP、LVSP值在缺血末期與再灌注末期均有明顯改善,與I/R組相比,差別有學(xué)統(tǒng)計(jì)意義。AS組的SP、±dp/dt max值在缺血末期改善不明顯,但在再灌注末期,有明顯改善,與I/R組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而I/R組、S組、Sc組的各項(xiàng)指標(biāo)差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.血清心肌酶CK、LDH活力分析:與Sham組相比,I/R組CK、LDH活力分別

8、增高1.13倍、2.96倍,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與I/R組相比,AS組能使CK、LDH活力分別下降32.69%、43.87%,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而I/R組、S組、Sc組CK、LDH活力差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　三.結(jié)論:
　　以上研究結(jié)果說明Egr-1 AS-ODN可有效抑制大鼠心肌I/R Egr-1蛋白的表達(dá),減輕心肌組織炎性反應(yīng)及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度,減輕心肌細(xì)胞的損傷,保護(hù)心肌功能?？梢?Egr-1在心肌I/R損傷的發(fā)生發(fā)