豬繁殖與呼吸綜合征病毒誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的，以仔豬呼吸困難和母豬繁殖障礙為主要特征的一種傳染病。2006年我國爆發(fā)了由HP-PRRSV引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。HP-PRRSV與經(jīng)典PRRSV相比致病性和傳播能力更強(qiáng)，引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的炎性反應(yīng)和免疫抑制更嚴(yán)重。作為重要的免疫抑制因子與抗炎因子，IL-10在病毒介導(dǎo)的免疫抑制中起重要作用。多個(gè)研究結(jié)果顯示PRRSV感染引起的對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制與IL-1

2、0的表達(dá)水平密切相關(guān)。目前對(duì)PRRSV感染后誘導(dǎo)機(jī)體IL-10表達(dá)水平上調(diào)機(jī)制的研究還不深入，開展PRRSV誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生機(jī)制的研究有利于更深入的了解PRRSV感染產(chǎn)生免疫抑制的基礎(chǔ)，為PRRS的防控提供有益的參考。
　　實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示:強(qiáng)毒株HuN4及其傳代致弱病毒HuN4-F112體內(nèi)感染豬后，HuN4株能夠誘發(fā)高水平的IL-10表達(dá)，而HuN4-F112感染后IL-10表達(dá)水平則很低。為研究PRRSV強(qiáng)弱毒感染后誘導(dǎo)

3、IL-10產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)，我們首先對(duì)PRRSV HuN4株強(qiáng)弱毒體外感染PAM細(xì)胞誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生水平進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:HuN4強(qiáng)弱毒感染PAM細(xì)胞后，誘導(dǎo)IL-10表達(dá)水平存在明顯差異，HuN4感染后誘導(dǎo)高水平的IL-10表達(dá)，而HuN4-F112感染后IL-10表達(dá)水平很低。對(duì)調(diào)節(jié)IL-10產(chǎn)生的通路研究結(jié)果顯示，HuN4強(qiáng)毒感染PAM細(xì)胞后與弱毒HuN4-F112相比能夠誘導(dǎo)TLR2與TLR4轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)， TLR7和TL

4、R9轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，TLR3轉(zhuǎn)錄水平則無明顯差異。對(duì)TLR下游的重要調(diào)節(jié)因子TRIF和MyD88轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果顯示:強(qiáng)毒感染PAM細(xì)胞后與弱毒HuN4-F112相比TRIF轉(zhuǎn)錄水平得到上調(diào)，MyD88轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著。對(duì)ERK與p38研究結(jié)果顯示:強(qiáng)毒HuN4感染PAM細(xì)胞后能夠持續(xù)上調(diào)p38磷酸化表達(dá)水平，而HuN4與HuN4-F112感染PAM細(xì)胞后ERK磷酸化水平無顯著變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):PRRSV HuN4強(qiáng)弱毒感染PAM細(xì)

5、胞后，誘導(dǎo)IL-10表達(dá)水平存在明顯差異，強(qiáng)毒顯著高于弱毒。強(qiáng)弱毒感染PAM細(xì)胞誘導(dǎo)IL-10表達(dá)水平的差異可能是由于強(qiáng)毒通過調(diào)控p38 MAPK磷酸化水平造成的。
　　為了探尋PRRSV基因組上對(duì)IL-10表達(dá)具有調(diào)控作用的區(qū)域，我們首先利用實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7、rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b和rHu

6、N4-F112-ORF2-7在體外感染PAM細(xì)胞，結(jié)果顯示PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)ORF1a以及結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)能夠顯著影響IL-10的表達(dá)。利用反向遺傳技術(shù)，將病毒nsp1、nsp2、nsp9-10和nsp9-11在強(qiáng)弱毒間進(jìn)行互換，獲得拯救病毒命名為rHuN4-F5-nsp1、rHuN4-F5-nsp2、rHuN4-F5-nsp9-1、rHuN4-F5-nsp9-11、rHuN4-F112-nsp1、rHuN4-F112-nsp2