豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白誘導豬肺泡巨噬細胞白介素-10表達的分子機制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗稱“藍耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的高度接觸性傳染病。該病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。PRRSV感染的典型特征是能夠引發(fā)豬體免疫抑制，使得先天免疫應答不足，獲得性免疫發(fā)展微弱，中和抗體應答遲緩，從而容易發(fā)生其它病毒或細菌的混合感染或繼發(fā)感染。

2、>　　細胞因子(cytokine，CK)是一類能在細胞間或細胞內部傳遞信息的蛋白質或小分子肽，許多細胞因子在先天免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著重要作用。白介素-10(IL-10)是一種具有免疫抑制性調節(jié)作用的多能細胞因子。能夠引發(fā)豬免疫抑制效應的多種病毒在感染宿主時均伴隨有明顯的IL-10上調，其中就包括PRRSV。我們研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV（ZCYZ株）核衣殼蛋白能夠顯著上調可傳代豬肺泡巨噬細胞的IL-10 mRNA水平。圍繞其具體分子機制的

3、解析工作，本論文開展了以下研究:
　　1.PRRSV（ZCYZ株）核衣殼蛋白真核表達載體的構建及活性鑒定
　　針對PRRSV ZCYZ株核衣殼蛋白基因序列設計特異性的表達引物，并在上游引物添加Flag標簽序列;目的基因和載體經雙酶切后連接構建pCI-neo-N載體;重組載體經PCR、雙酶切、測序驗證連接成功后，運用間接免疫熒光(IFA)和Western-blot檢測目的蛋白的生物學特性。結果表明，成功構建能夠表達PRRSV（

4、ZCYZ株）核衣殼蛋白的真核表達載體。
　　2.豬IL-10 SYBR GreenⅠ real-time PCR檢測方法的建立
　　本試驗針對豬IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分別設計一對特異性引物，構建了各自含有IL-10、β-actin引物擴增序列的重組質粒為陽性標準品，建立了以2-△△Ct為基礎的SYBR GreenⅠ real-time PCR檢測方法。該方法線性關系良好;敏感性高，兩種基因的檢測下限均

5、為1×101copies/μL;特異性強，擴增產物形成單一的特異性熔解峰;重復性良好，組內變異系數(shù)小于2％，組間變異系數(shù)小于3％;目的基因及內參基因的擴增效率較高，分別為92.7％、97.8％。綜上所述，該方法可以用于豬IL-10mRNA水平的表達分析。
　　3.PRRSV(ZCYZ株)核衣殼蛋白誘導豬肺泡巨噬細胞IL-10表達的分子機制研究
　　我們發(fā)現(xiàn)PRRSV(ZCYZ株)核衣殼蛋白能夠誘導豬肺泡巨噬細胞IL-10表達

6、，但具體分子機制還尚不清楚。本試驗探索了核衣殼蛋白（N蛋白）轉染時間與轉染劑量誘導IL-10表達的動力學規(guī)律。通過研究MAPK、PI3K以及NF-κB等相關信號通路初步闡釋了N蛋白誘導豬PAM細胞IL-10 mRNA升高的分子機制。利用蛋白解析技術試圖探索N蛋白中誘導IL-10表達的關鍵氨基酸區(qū)段以及位點，但所有構建的N蛋白缺失突變體均顯著喪失了上調IL-10表達的能力，揭示N蛋白的完整性對于誘導IL-10表達至關重要;最后我們選取仍保