豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞白介素-10表達(dá)的分子機(jī)制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗稱“藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的高度接觸性傳染病。該病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV感染的典型特征是能夠引發(fā)豬體免疫抑制，使得先天免疫應(yīng)答不足，獲得性免疫發(fā)展微弱，中和抗體應(yīng)答遲緩，從而容易發(fā)生其它病毒或細(xì)菌的混合感染或繼發(fā)感染。

2、>　　細(xì)胞因子(cytokine，CK)是一類能在細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)部傳遞信息的蛋白質(zhì)或小分子肽，許多細(xì)胞因子在先天免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著重要作用。白介素-10(IL-10)是一種具有免疫抑制性調(diào)節(jié)作用的多能細(xì)胞因子。能夠引發(fā)豬免疫抑制效應(yīng)的多種病毒在感染宿主時(shí)均伴隨有明顯的IL-10上調(diào)，其中就包括PRRSV。我們研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV（ZCYZ株）核衣殼蛋白能夠顯著上調(diào)可傳代豬肺泡巨噬細(xì)胞的IL-10 mRNA水平。圍繞其具體分子機(jī)制的

3、解析工作，本論文開展了以下研究:
　　1.PRRSV（ZCYZ株）核衣殼蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及活性鑒定
　　針對PRRSV ZCYZ株核衣殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異性的表達(dá)引物，并在上游引物添加Flag標(biāo)簽序列;目的基因和載體經(jīng)雙酶切后連接構(gòu)建pCI-neo-N載體;重組載體經(jīng)PCR、雙酶切、測序驗(yàn)證連接成功后，運(yùn)用間接免疫熒光(IFA)和Western-blot檢測目的蛋白的生物學(xué)特性。結(jié)果表明，成功構(gòu)建能夠表達(dá)PRRSV（

4、ZCYZ株）核衣殼蛋白的真核表達(dá)載體。
　　2.豬IL-10 SYBR GreenⅠ real-time PCR檢測方法的建立
　　本試驗(yàn)針對豬IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分別設(shè)計(jì)一對特異性引物，構(gòu)建了各自含有IL-10、β-actin引物擴(kuò)增序列的重組質(zhì)粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，建立了以2-△△Ct為基礎(chǔ)的SYBR GreenⅠ real-time PCR檢測方法。該方法線性關(guān)系良好;敏感性高，兩種基因的檢測下限均

5、為1×101copies/μL;特異性強(qiáng)，擴(kuò)增產(chǎn)物形成單一的特異性熔解峰;重復(fù)性良好，組內(nèi)變異系數(shù)小于2％，組間變異系數(shù)小于3％;目的基因及內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率較高，分別為92.7％、97.8％。綜上所述，該方法可以用于豬IL-10mRNA水平的表達(dá)分析。
　　3.PRRSV(ZCYZ株)核衣殼蛋白誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞IL-10表達(dá)的分子機(jī)制研究
　　我們發(fā)現(xiàn)PRRSV(ZCYZ株)核衣殼蛋白能夠誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞IL-10表達(dá)

6、，但具體分子機(jī)制還尚不清楚。本試驗(yàn)探索了核衣殼蛋白（N蛋白）轉(zhuǎn)染時(shí)間與轉(zhuǎn)染劑量誘導(dǎo)IL-10表達(dá)的動力學(xué)規(guī)律。通過研究MAPK、PI3K以及NF-κB等相關(guān)信號通路初步闡釋了N蛋白誘導(dǎo)豬PAM細(xì)胞IL-10 mRNA升高的分子機(jī)制。利用蛋白解析技術(shù)試圖探索N蛋白中誘導(dǎo)IL-10表達(dá)的關(guān)鍵氨基酸區(qū)段以及位點(diǎn)，但所有構(gòu)建的N蛋白缺失突變體均顯著喪失了上調(diào)IL-10表達(dá)的能力，揭示N蛋白的完整性對于誘導(dǎo)IL-10表達(dá)至關(guān)重要;最后我們選取仍保