肺炎常見(jiàn)致病菌及其耐藥特性快速識(shí)別生物學(xué)芯片的構(gòu)建.pdf

1、目的:肺炎是世界上常見(jiàn)的一種感染性疾病，可發(fā)生在各個(gè)年齡階段，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。細(xì)菌是肺炎最重要的致病原之一，不能及時(shí)明確致病菌的種類及其耐藥特性往往導(dǎo)致細(xì)菌性肺炎治療失敗。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法是檢測(cè)細(xì)菌的金標(biāo)準(zhǔn)，但需要的時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)于一些菌種檢出率低，不能滿足臨床快速診斷的需求。同樣，抗菌藥物敏感性試驗(yàn)雖然能直觀的反應(yīng)結(jié)果，但該方法所需時(shí)間長(zhǎng)，影響因素多，而且對(duì)培養(yǎng)條件苛刻的細(xì)菌不適用，不能及時(shí)指導(dǎo)臨床用藥。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建常見(jiàn)肺炎致病菌

2、及其相關(guān)耐藥基因的檢測(cè)生物學(xué)芯片，為臨床早診斷和早治療提供檢測(cè)手段。
　　方法:首先設(shè)計(jì)靶基因的引物和探針，其中肺炎致病菌鑒定芯片選取常見(jiàn)肺炎致病菌，以16S rDNA和特異基因作為檢測(cè)的靶基因，肺炎致病菌耐藥基因檢測(cè)芯片則選取臨床意義明確的耐藥基因，從PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中下載所有目的序列，通過(guò)序列比對(duì)設(shè)計(jì)出所需的引物和探針。然后進(jìn)行引物探針的篩選、質(zhì)粒參考品的構(gòu)建、多重不對(duì)稱PCR條件的優(yōu)化，主要是對(duì)引物間的搭配和引物濃度等擴(kuò)增

3、體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。最后對(duì)芯片的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，以質(zhì)粒參考品對(duì)芯片的靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證，以標(biāo)準(zhǔn)菌株或質(zhì)粒菌對(duì)芯片特異性進(jìn)行驗(yàn)證，以陽(yáng)性參考品對(duì)芯片重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證，如果有靈敏度低或特異性差的探針需要重新設(shè)計(jì)和驗(yàn)證。
　　結(jié)果:根據(jù)肺炎致病菌流行病學(xué)特點(diǎn)，選取了15種細(xì)菌作為靶致病菌，包括肺炎鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎衣原體、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎支原體、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、糞腸

4、球菌、屎腸球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、大腸埃希菌和陰溝腸桿菌。肺炎致病菌鑒定芯片，以致病菌16S rDNA和特異基因?yàn)榘谢蚱?，成功?gòu)建了15種菌的30個(gè)質(zhì)粒參考品，篩選出了16對(duì)引物和32條探針。肺炎致病菌耐藥基因檢測(cè)芯片，則以24種耐藥基因?yàn)槟康钠危晒?gòu)建了24個(gè)質(zhì)粒參考品，篩選出了24對(duì)引物和27條探針。兩種芯片均成功建立了多重PCR的反應(yīng)條件和擴(kuò)增體系，芯片靈敏度均能達(dá)到103copies/μl，能正確檢測(cè)出目的基因，通過(guò)重復(fù)性檢驗(yàn)