FTA濾膜用于基因芯片檢測肉中常見食源性致病菌的研究.pdf

1、通過不對稱PCR技術和基因芯片技術建立了一種準確、快速和高敏感性的檢測肉中常見食源性致病菌的方法。用FTA濾膜從食品樣品中直接提取模板DNA。用玻片作基因芯片的固相載體。選擇常見的引起食物中毒的15株菌的16SrDNA基因的一個片段作為目的基因。設計這段基因的一對通用引物，下游引物用Cy5標記。對兩輪不對稱PCR反應體系中退火溫度、Mg2+濃度進行了優(yōu)化，以確定適宜PCR反應體系和PCR擴增程序。第一輪適宜反應體系分別為:5uL的10×

2、PCR buffer，0.5uL的20mmol/L，dNTP，引物F1、R2各luL(25umol/L)，0.5uL的Taq酶(2.5U)，含有基因組DNA模板的濾膜，用去離子水補足到50 uL。循環(huán)的條件為:94℃變性5min，從94℃變性30s、58.8℃退火1 min到72℃延伸30s共25個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。第二輪適宜反應體系為:5uL的10×PCR buffer，0.5uL的20 mmol/L dNTP，引物R2

3、 luL(25umol/L)，0.5uL的Taq酶(25U)，第一輪的PCR產(chǎn)物1.5uL，用去離子水補足到50uL。循環(huán)的條件為:94℃變性5 min，從94℃變性30s、55.6℃退火30s到72℃延伸30s共30個循環(huán)，最后72℃延伸5min。設計二十五條種屬的特異性探針，將它們氨基化修飾并點到玻片上，將不對稱PCR的15種擴增產(chǎn)物與制作好的基因芯片雜交，用genepix4對雜交結(jié)果進行分析。 結(jié)果表明10株食源性致病菌(

4、金黃色葡萄球菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、霍亂弧菌、普通變形桿菌、擬態(tài)弧菌、單核增生李斯特菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、臘樣芽孢桿菌)的檢測具有高敏感性和特異性；副溶血性弧菌的敏感性相對較低；河流弧菌同副溶血性弧菌存在很弱的錯雜交，乙型溶血性鏈球菌的檢測同單核增生李斯特菌和臘樣芽孢桿菌存在很弱的錯雜交，但是均不影響檢測結(jié)果。大腸桿菌O157:H7和沙門氏菌由于同源性非常高，可以通過多重PCR方法檢測出來。整個樣品的檢測

5、過程耗時6h。本方法檢測靈敏度是102CFU/mL。 針對在線BLAST的不足，建立了16SrDNA基因核苷酸序列本地數(shù)據(jù)庫，并在此基礎上進行寡核苷酸探針的本地BLAST以確保其特異性。通過與在線BLAST比較，本地BLAST在準確性、冗余信息的去除以及使用簡便性等方面要優(yōu)于在線BLAST。 基因芯片相比較其它檢測方法有很大的優(yōu)勢，它不僅準確、快速、高效，而且高通量，可廣泛應用于食源性致病菌感染的診斷、應對和控制。