快速檢測(cè)腸道致病菌的PCR技術(shù)的研究.pdf

1、食品安全是一個(gè)越來(lái)越引起人們重視的問(wèn)題，不僅影響到人們的生活、工作和健康，更是關(guān)系到國(guó)計(jì)民生的大事。在各種食物中毒中，細(xì)菌性食物中毒是食物中毒的主要因素。食品中的腸道致病菌是引起人類食源性疾病的主要原因之一，而傳統(tǒng)的病原微生物檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，操作煩瑣，對(duì)有些細(xì)菌也不能給出理想的鑒定結(jié)果，在實(shí)際運(yùn)用中遇到越來(lái)越多的問(wèn)題。鑒于此，我們對(duì)當(dāng)前最先進(jìn)、最敏感的PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行研究，在于建立快速簡(jiǎn)便、定量準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的檢測(cè)方法

2、。本文針對(duì)在我國(guó)食物中毒中最常見(jiàn)的腸科桿菌進(jìn)行研究，尋找食物中毒診斷及醫(yī)療衛(wèi)生檢驗(yàn)的有效途徑。本文涉及的腸科桿菌有產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌、侵襲性大腸埃希菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬等。 多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系中加入二對(duì)以上的引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。多重PCR具有高效性，系統(tǒng)性，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性等特點(diǎn)。首先篩選出種或?qū)匍g特異性基因序列，按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)調(diào)整MgCl<,2>濃度、引物濃度

3、、Taq酶用量、模板濃度、退火溫度和循環(huán)數(shù)參數(shù)等，優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系。這些目的基因的引物在一個(gè)混合的PCR體系中擴(kuò)增出各自的基因片段，并且特異性、靈敏度都和單獨(dú)PCR擴(kuò)增近似，幾種菌隨機(jī)組合的擴(kuò)增也很成功，未出現(xiàn)相互間強(qiáng)抑制現(xiàn)象。所用時(shí)間也與單獨(dú)PCR相同，從處理樣品開(kāi)始僅需要2～3h就可得到結(jié)果。同時(shí)我們對(duì)樣品的檢測(cè)與食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的符合率達(dá)100％。組裝的試劑盒穩(wěn)定性和重復(fù)性很好，因此該試劑盒有一定的應(yīng)用價(jià)值，可在生產(chǎn)實(shí)

4、踐中推廣應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、無(wú)需PCR反應(yīng)后處理步驟等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于食品和臨床檢驗(yàn)方面。本研究針對(duì)編碼產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌的耐熱腸毒素ST Ⅰ和不耐熱腸毒素LT Ⅰ的基因片段設(shè)計(jì)引物、探針，分別使用的是MGB-Taqman探針和普通的Taqman探針。制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，探索實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，檢測(cè)PCR反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度，得到熒光定量PCR的反應(yīng)曲線。由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線