Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶對洛伐他汀羥基化的影響及P450酶基因部分克隆.pdf

1、他汀類藥物屬于羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，為降脂藥物中的首選藥物，也是國內外研究的熱點之一。無錫他汀(本實驗室擁有自主知識產權)是一種新型HMG-CoA還原酶抑制劑，由洛伐他汀經擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.ST2710)轉化產生。本文主要對Amycolatopsis sp.ST2710轉化洛伐他汀為無錫他汀的轉化過程中的相關酶進行了初步的研究，分析了轉化過程中相關酶的酶活與洛伐他汀轉化之間的關系，

2、并克隆了該酶的部分基因序列，初步確定該酶為CYP450羥基化酶。
　　 首先，在國內外文獻的基礎上，確立Amycolatopsis CGMCC No1149 P450酶測定方法為一氧化碳差光譜法，這一方法是根據還原型P450酶與CO結合以后在450nm處有一特征吸收峰的特性建立的。對Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶測定方法進行了優(yōu)化。主要考察了破壁方法，溫度，pH以及緩沖體系對酶活測定的影響。最終確

3、立酶活測定條件：以超聲波破碎細胞獲得細胞抽提液，溫度為室溫，緩沖體系為pH7.4磷酸緩沖液，CO結合時間2 min，紫外分光光度計從400 nm向500 nm掃描。其中波長450 nm處的吸光率即代表了該CYPP450羥基化酶的酶活。
　　 為了判斷P450酶與底物羥基化的關系，考察了Amycolatopsis CGMCC No1149 P450酶對洛伐他汀轉化率的影響。通過改變培養(yǎng)基初始pH，轉化溫度，底物濃度，溶氧等因素，考

4、察P450酶活的變化及相應的洛伐他汀轉化率的變化。結果發(fā)現，pH，溫度，底物濃度，溶氧等均對P450的酶活有較大影響，其變化趨勢與轉化率的變化一致。同時，研究了在添加適量金屬離子情況下P450酶活變化情況，其中添加Mg2+、Fe2+、Cu2+后酶活有顯著提高，同時對轉化又明顯的促進作用。研究結果表明，洛伐他汀的轉化跟Amycolatopsis sp.ST2710中的細胞色素P450酶的酶活性密切相關。
　　 通過對所查到的CYP

5、450基因的序列進行分析，利用保守區(qū)進行簡并PCR，克隆了P450酶基因部分基因片段，其長度為0.52 kb，經序列分析發(fā)現其與Amycolatopsis azureaCYP450基因核苷酸序列相似性最高，同源性達到了92％。對該基因片段所編碼的氨基酸序列進行了分析，并與其他相關的CYP450氨基酸片段做了同源性比對，發(fā)現它們之間的同源性大都超過了60％，為同一亞家族成員。從而在分子生物學的角度初步判斷CYP450是Amycolatop