Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶對(duì)洛伐他汀羥基化的影響及P450酶基因部分克隆.pdf

1、他汀類藥物屬于羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，為降脂藥物中的首選藥物，也是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。無(wú)錫他汀(本實(shí)驗(yàn)室擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán))是一種新型HMG-CoA還原酶抑制劑，由洛伐他汀經(jīng)擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis sp.ST2710)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。本文主要對(duì)Amycolatopsis sp.ST2710轉(zhuǎn)化洛伐他汀為無(wú)錫他汀的轉(zhuǎn)化過(guò)程中的相關(guān)酶進(jìn)行了初步的研究，分析了轉(zhuǎn)化過(guò)程中相關(guān)酶的酶活與洛伐他汀轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系，

2、并克隆了該酶的部分基因序列，初步確定該酶為CYP450羥基化酶。
　　 首先，在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，確立Amycolatopsis CGMCC No1149 P450酶測(cè)定方法為一氧化碳差光譜法，這一方法是根據(jù)還原型P450酶與CO結(jié)合以后在450nm處有一特征吸收峰的特性建立的。對(duì)Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶測(cè)定方法進(jìn)行了優(yōu)化。主要考察了破壁方法，溫度，pH以及緩沖體系對(duì)酶活測(cè)定的影響。最終確

3、立酶活測(cè)定條件：以超聲波破碎細(xì)胞獲得細(xì)胞抽提液，溫度為室溫，緩沖體系為pH7.4磷酸緩沖液，CO結(jié)合時(shí)間2 min，紫外分光光度計(jì)從400 nm向500 nm掃描。其中波長(zhǎng)450 nm處的吸光率即代表了該CYPP450羥基化酶的酶活。
　　 為了判斷P450酶與底物羥基化的關(guān)系，考察了Amycolatopsis CGMCC No1149 P450酶對(duì)洛伐他汀轉(zhuǎn)化率的影響。通過(guò)改變培養(yǎng)基初始pH，轉(zhuǎn)化溫度，底物濃度，溶氧等因素，考

4、察P450酶活的變化及相應(yīng)的洛伐他汀轉(zhuǎn)化率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH，溫度，底物濃度，溶氧等均對(duì)P450的酶活有較大影響，其變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)化率的變化一致。同時(shí)，研究了在添加適量金屬離子情況下P450酶活變化情況，其中添加Mg2+、Fe2+、Cu2+后酶活有顯著提高，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)化又明顯的促進(jìn)作用。研究結(jié)果表明，洛伐他汀的轉(zhuǎn)化跟Amycolatopsis sp.ST2710中的細(xì)胞色素P450酶的酶活性密切相關(guān)。
　　 通過(guò)對(duì)所查到的CYP

5、450基因的序列進(jìn)行分析，利用保守區(qū)進(jìn)行簡(jiǎn)并PCR，克隆了P450酶基因部分基因片段，其長(zhǎng)度為0.52 kb，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)其與Amycolatopsis azureaCYP450基因核苷酸序列相似性最高，同源性達(dá)到了92％。對(duì)該基因片段所編碼的氨基酸序列進(jìn)行了分析，并與其他相關(guān)的CYP450氨基酸片段做了同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們之間的同源性大都超過(guò)了60％，為同一亞家族成員。從而在分子生物學(xué)的角度初步判斷CYP450是Amycolatop