豐富生存環(huán)境對(duì)小鼠腫瘤的抑制作用及其整合生物學(xué)研究.pdf

1、癌癥是一種系統(tǒng)性疾病。癌癥雖然表現(xiàn)為局部組織細(xì)胞的異常生長(zhǎng)，但機(jī)體的神經(jīng)、免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)都伴有相應(yīng)的改變，并對(duì)癌癥的發(fā)生和發(fā)展起著重要的調(diào)控作用。
　　環(huán)境因素對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的影響傳統(tǒng)上局限于理化研究。作為一種良性應(yīng)激，豐富生存環(huán)境（Enriched Environment，EE）被廣泛用來(lái)研究環(huán)境對(duì)腦功能的影響，包括對(duì)正常動(dòng)物模型以及各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型的研究。關(guān)于豐富環(huán)境對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展影響的研究，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。為此，

2、本課題擬開(kāi)展以下兩方面的開(kāi)拓性工作：
　　1.建立豐富生存環(huán)境飼養(yǎng)條件下的小鼠移植瘤模型，觀察精神行為因素對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響作用；
　　2.在上述動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，通過(guò)整合生物學(xué)研究，探索可能與豐富生存環(huán)境抑瘤作用相關(guān)的通路及機(jī)制。
　　第一部分豐富生存環(huán)境腫瘤小鼠模型的建立
　　目的：建立豐富生存環(huán)境飼養(yǎng)條件下的小鼠移植瘤模型，觀察精神行為因素對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響作用。
　　方法：建立小鼠豐富生存環(huán)境及標(biāo)

3、準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境。EE：在60cm×40cm×20 cm的透明大鼠籠內(nèi)，鋪覆墊料，設(shè)置小屋、斜梯、隧道、塑料跑輪、躲避處、棉花、各種形狀及顏色的玩具,在小鼠浴室和廁所里分別撒放浴沙和鼠沙。每籠安置12只小鼠，每2～3d清潔并更換籠具及玩具。每周對(duì)小鼠進(jìn)行稱重并記錄。小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境：于30cm×18 cm×25 cm的小鼠籠內(nèi)，每籠4只小鼠，籠底鋪設(shè)墊料。環(huán)境溫度均保持21～23℃，維持12 h照明、12 h黑暗的光照周期，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食、

4、飲水。
　　將C57BL/6雄性小鼠分別置于豐富生存環(huán)境和標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)3周，皮下接種Panc02胰腺癌、B16F10黑色素瘤和Lewis肺癌細(xì)胞，繼續(xù)在原有環(huán)境飼養(yǎng)3-5周，腫瘤生長(zhǎng)曲線。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，稱量瘤重，計(jì)算抑瘤率，并保存小鼠血清、瘤體及各器官組織樣本進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。選擇C57BL/6雌性小鼠分別建立Panc02胰腺癌和B16F10黑色素瘤模型。選擇BALB/c雄性小鼠建立CT-26及CT-26sci結(jié)腸癌模型。

5、
　　結(jié)果：在C57BL/6雄性小鼠皮下移植瘤模型中，EE對(duì)Panc02胰腺癌、B16F10黑色素瘤和Lewis肺癌的抑瘤率分別為58.2％（EE組0.23±0.12g v.s.對(duì)照組0.55±0.14g， P<0.001）、43.1%（EE組2.01±2.11g v.s.對(duì)照組3.53±2.24g， P=0.05）及36.5%（EE組2.51±0.25g v.s.對(duì)照組3.95±0.26g，P<0.01）。免疫組化證實(shí)EE小鼠瘤

6、體中PCNA表達(dá)較對(duì)照小鼠瘤體細(xì)胞顯著下降，進(jìn)一步提示了EE對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用。
　　在C57BL/6雌性小鼠的Panc02胰腺癌模型中，EE組腫瘤大小與對(duì)照組無(wú)明顯差異（EE組0.94±0.21 vs.對(duì)照組0.96±0.23g，P>0.05）。同樣，在B16F10黑色素瘤模型中，EE對(duì)C57BL/6雌性小鼠的抑瘤作用也無(wú)顯著意義（EE組1.28±0.27g vs.對(duì)照組1.53±0.25g，P=0.497），表明EE

7、對(duì)腫瘤的抑制作用具有性別特異性。
　　在BALB/c雄性小鼠的CT26結(jié)腸癌模型，豐富環(huán)境組小鼠腫瘤重量與對(duì)照無(wú)顯著差異（EE組3.67±1.14g vs.對(duì)照組3.16±1.02g，P=0.382）。同樣，在BALB/c雄性小鼠的CT26-sci結(jié)腸癌模型中，豐富環(huán)境組小鼠腫瘤重量與對(duì)照組也無(wú)顯著差異（EE組4.11±0.92g vs.對(duì)照組3.40±1.19g，P=0.105），表明EE的抑瘤作用受小鼠品系的影響。
　　

8、為了探索運(yùn)動(dòng)、社交等因素是否為EE抑瘤的決定因素，我們?cè)O(shè)立了單純運(yùn)動(dòng)組（常規(guī)飼養(yǎng)籠中加跑輪運(yùn)動(dòng)）、單純社交組（12只小鼠置于沒(méi)有玩具和運(yùn)動(dòng)器材的大籠中飼養(yǎng)）以及社交缺乏組（即2只小鼠置有玩具及運(yùn)動(dòng)器材的大籠中飼養(yǎng)），結(jié)果顯示，社交缺乏組、單純社交組及單純運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組相比，抑瘤率分別為15.5%、17.4%和14.8%。表明EE環(huán)境對(duì)腫瘤的抑制作用是活動(dòng)和社交綜合作用的結(jié)果。
　　結(jié)論：豐富生存環(huán)境對(duì)雄性C57BL/6小鼠移植性腫

9、瘤具有廣泛且顯著的抑制作用，該作用可能具有性別及種系差異。
　　胰腺癌的發(fā)生發(fā)展是多信號(hào)通路、多機(jī)制作用的結(jié)果。豐富生存環(huán)境可以顯著抑制小鼠皮下抑制瘤的生長(zhǎng)，其中以對(duì)Panc02胰腺癌皮下移植瘤的作用最為顯著。為揭示其抑瘤機(jī)制，我們對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因組學(xué)及蛋白組學(xué)分析。對(duì)Panc02胰腺癌瘤體組織的基因水平和蛋白水平的深入研究，有助于闡明豐富生存環(huán)境與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，可能對(duì)胰腺癌防治提供思路和線索。
　　目的：采用小鼠

10、全基因組表達(dá)譜及定量蛋白質(zhì)譜檢測(cè)對(duì)Panc02胰腺癌瘤體組織進(jìn)行高通量基因表達(dá)及蛋白水平分析，用生物信息學(xué)方法探索豐富生存環(huán)境對(duì)Panc02胰腺癌瘤體生長(zhǎng)的影響。
　　方法：抽提Panc02胰腺癌瘤體RNA及蛋白，采用Agilent Whole Genome Microarry4×44K小鼠全基因組表達(dá)譜芯片及iTRAQ標(biāo)記蛋白質(zhì)譜定量分析對(duì)Panc02胰腺癌瘤體組織分別進(jìn)行小鼠全基因組表達(dá)譜分析及蛋白質(zhì)譜檢測(cè)，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件

11、GeneSpring11.5尋找差異基因及蛋白，并使用DAVID軟件進(jìn)行相應(yīng)的基因本體學(xué)及通路分析。
　　結(jié)果：小鼠全基因組基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，在豐富生存環(huán)境條件下，Panc02胰腺癌組織在基因表達(dá)水平上發(fā)生了廣泛而顯著的變化，該變化以向下調(diào)節(jié)為主?；虮倔w分析顯示Panc02胰腺癌組織在生物學(xué)過(guò)程的變化以粘附、發(fā)育、運(yùn)動(dòng)為主；細(xì)胞組分以細(xì)胞連接、細(xì)胞骨架及膜結(jié)構(gòu)等為主；分子功能則以結(jié)合及分子活性為主。這些基因本體學(xué)條目均與腫

12、瘤增殖、遷移、侵襲等特征密切相關(guān)，可能是豐富生存環(huán)境對(duì)腫瘤抑制作用的潛在機(jī)制。
　　對(duì)Panc02胰腺癌基因表達(dá)譜2倍以上差異基因的KEGG通路分析顯示，在豐富生存環(huán)境條件下，Panc02胰腺癌組織不但在多條代謝通路上發(fā)生顯著變化，同時(shí)在帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病等神經(jīng)精神疾病相關(guān)通路上也發(fā)生顯著富集。對(duì)基因表達(dá)譜5倍以上差異基因的KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)這些神經(jīng)精神疾病相關(guān)通路富集在2倍到5倍差異基因區(qū)間。
　　對(duì)Pan

13、c02胰腺癌組織進(jìn)行定量蛋白質(zhì)譜檢測(cè)，獲得1.5倍以上差異蛋白1658個(gè)，其中上調(diào)1.5倍以上者242個(gè)，下調(diào)1.5倍以上者380個(gè)。進(jìn)行KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白也在帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病等神經(jīng)精神疾病相關(guān)通路上發(fā)生顯著富集。對(duì)基因表達(dá)譜2倍以上差異基因及1.5倍以上差異蛋白的進(jìn)行交集分析后進(jìn)一步確認(rèn)，在豐富生存環(huán)境下Panc02胰腺癌組織在神經(jīng)精神疾病相關(guān)通路上發(fā)生顯著富集。
　　結(jié)論：在豐富生存環(huán)境條件下，

14、Panc02胰腺癌瘤體中基因表達(dá)發(fā)生了廣泛和顯著的改變，且富集于帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病等神經(jīng)退行性變相關(guān)通路上。其是否為EE抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵分子和核心機(jī)制，值得深入探討。
　　第三部分豐富生存環(huán)境對(duì)神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的生物信息學(xué)研究
　　豐富生存環(huán)境的本質(zhì)是一種良性應(yīng)激，其作用的發(fā)揮必然涉及神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控及應(yīng)激反應(yīng)。豐富生存環(huán)境抗腫瘤作用可能涉及一系列的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控，這項(xiàng)多臟器、多系統(tǒng)的復(fù)雜工程需通過(guò)系統(tǒng)生物學(xué)

15、研究方能全面揭示。
　　目的：對(duì)豐富生存環(huán)境與標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境的未荷瘤及短期荷瘤刺激小鼠海馬、下丘腦-垂體-腎上腺軸進(jìn)行全基因組基因表達(dá)譜芯片分析，運(yùn)用生物信息學(xué)方法探索在豐富生存環(huán)境下腦部如何影響腫瘤的生長(zhǎng)。
　　方法：建立豐富生存環(huán)境及標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境。分別獲得未荷瘤 C57BL/6雄性小鼠和接受短期腫瘤刺激的C57BL/6小鼠的海馬、下丘腦、垂體、腎上腺。抽提總RNA后進(jìn)一步純化進(jìn)行小鼠全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)。對(duì)海馬表達(dá)譜芯片

16、結(jié)果進(jìn)行差異基因篩選、基因本體學(xué)及 KEGG通路分析。對(duì)荷瘤小鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸表達(dá)譜芯片采用基因及富集分析。
　　結(jié)果：對(duì)海馬基因表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)，在豐富生存環(huán)境下未荷瘤小鼠及荷瘤小鼠海馬基因表達(dá)譜均發(fā)生顯著變化。在豐富生存環(huán)境下，荷瘤小鼠與未荷瘤小鼠的共同上調(diào)基因富集在神經(jīng)活性配體受體交互作用通路，而共同下調(diào)基因富集在G蛋白偶聯(lián)信號(hào)通路上。在豐富生存環(huán)境下，荷瘤小鼠海馬共有520個(gè)基因的mRNA發(fā)生了2倍以上的改變，其

17、中上調(diào)基因224個(gè)，下調(diào)基因296個(gè)。在224個(gè)上調(diào)基因中，有198個(gè)基因在未荷瘤小鼠中不受EE的誘導(dǎo)，提示他們可能特異性地與EE的抗腫瘤作用有關(guān)。KEGG分析顯示，這198個(gè)基因主要涉及ErbB signaling pathway和Adherens junction通路；在296個(gè)下調(diào)基因中，同樣有264個(gè)基因在未荷瘤小鼠中不受EE的誘導(dǎo)而改變，它們主要富集在Vascular smooth muscle contraction通路。腦

18、源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）是以往報(bào)道較多的在EE環(huán)境中顯著上調(diào)的一種蛋白，因此我們?cè)谛酒Y(jié)果中重點(diǎn)觀察了該蛋白在海馬中的改變規(guī)律。與非荷瘤標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境相比，非荷瘤豐富生存環(huán)境、荷瘤標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境、荷瘤豐富生存環(huán)境海馬BDNF的表達(dá)倍數(shù)分別為1.80、2.17、2.57倍，提示BDNF可能介導(dǎo)大腦對(duì)EE反應(yīng)后的抗腫瘤效應(yīng)。
　　對(duì)未荷瘤小鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸基因表達(dá)譜的基因本體及 KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，下丘腦-垂體-腎上腺軸腺體發(fā)育、分

19、泌等條目及神經(jīng)活性配體-受體交互作用通路在豐富生存環(huán)境下顯著富集。
　　基因集富集分析顯示，在豐富生存環(huán)境條件下，HPA軸基因表達(dá)譜在165個(gè)KEGG基因集中有52個(gè)發(fā)生上調(diào)，其中3條基因集FDR小于25%，涉及鞘糖脂合成、糖基磷脂酰肌醇合成及基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄；而在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境組，HPA軸基因表達(dá)譜在165個(gè)基因集中有113個(gè)發(fā)生上調(diào)，其中6條基因集FDR小于25%，與細(xì)胞分裂、同源重組、RNA聚合酶等通路有關(guān)。
　　結(jié)論：豐富生存