Tim-4對(duì)小鼠免疫性肝炎的抑制作用研究.pdf

1、TIM基因家族是2001年在對(duì)哮喘的研究中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因家族，定位于小鼠染色體1181.1，該區(qū)域與多種疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系，如哮喘、過敏反應(yīng)和自身免疫病等。小鼠Tim家族有8個(gè)基因，包括編碼蛋白Tim-1～4和4個(gè)假想蛋白Tim-5～8。Tim-l表達(dá)在Th2細(xì)胞和活化的初始T細(xì)胞表面；Tim-2選擇性表達(dá)于Th2細(xì)胞表面，負(fù)性調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞的增殖分化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生；Tim-3選擇性表達(dá)在Th1細(xì)胞表面，負(fù)性調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的

2、免疫應(yīng)答；而Tim-4主要表達(dá)在活化的APC表面，然而它對(duì)APCs自身功能的影響尚未見有報(bào)道。近幾年來的大量研究表明，表達(dá)于免疫細(xì)胞表面的Tim分子對(duì)免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。 不同于其它的Tim分子，Tim-4并不表達(dá)在T細(xì)胞表面，而是在mRMA和蛋白水平都表達(dá)于APCs表面，特別是髓系來源的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面。研究表明，它與表達(dá)于T細(xì)胞表面的Tim-1分子或另一個(gè)未知的分子相互作用，向T細(xì)胞傳導(dǎo)活化或抑制信號(hào)，這是T

3、im-4分子作為配體而發(fā)揮的功能。然而近來的研究表明，Tim-4可以作為磷脂酰絲氨酸的受體，通過與凋亡細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，促進(jìn)對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬，這是Tim-4分子作為受體的另一種功能展示。這也就提示，表達(dá)于APCs表面的Tim-4分子可能對(duì)APCs的活性具有一定的調(diào)節(jié)作用。 為了明確Tim-4分子是否對(duì)APCs細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，本課題組前期以巨噬細(xì)胞為研究模型，體外實(shí)驗(yàn)研究表明：小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7表達(dá)內(nèi)源性Ti

4、m-4，經(jīng)絲裂原LPS刺激后，Tim-4 mRNA及蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性上調(diào)；建立了過表達(dá)Tim-4的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7-Tim-4，利用該細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，Tim-4可通過影響NO分泌、iNOS、TNF-α的表達(dá)及共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)負(fù)性調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的生物學(xué)活性。 基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究擬利用小鼠免疫性肝炎模型進(jìn)一步論證Tim-4在體內(nèi)對(duì)巨噬細(xì)胞的負(fù)調(diào)控作用。大量的研究表明巨噬細(xì)胞

5、對(duì)刀豆蛋白A（ConA）誘發(fā)的小鼠急性肝損傷模型發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。因此，我們以這一經(jīng)典模型為基礎(chǔ)，在體內(nèi)進(jìn)一步論證Tim-4對(duì)巨噬細(xì)胞的抑制作用。首先，利用GdCl3清除小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞。然后，再分別尾靜脈轉(zhuǎn)輸過表達(dá)Tim-4的巨噬細(xì)胞系和空載體對(duì)照細(xì)胞系。最后，用ConA誘發(fā)小鼠急性肝損傷，于不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，通過檢測(cè)小鼠血清ALT的水平、HE染色和TUNEL染色評(píng)價(jià)肝臟的損傷程度，以及用ELISA的方法來分析不同實(shí)驗(yàn)組小鼠血

6、清中的TNF-α分泌情況。 研究結(jié)果顯示，RAW264.7-Tim-4細(xì)胞轉(zhuǎn)輸組小鼠血清ALT水平顯著低于對(duì)照細(xì)胞轉(zhuǎn)輸組；HE染色結(jié)果以及TUNEL檢測(cè)結(jié)果都表明，RAW264.7-Tim-4細(xì)胞轉(zhuǎn)輸組小鼠的肝臟損傷程度顯著低于對(duì)照細(xì)胞轉(zhuǎn)輸組。另外發(fā)現(xiàn)RAW264.7-Tim-4細(xì)胞轉(zhuǎn)輸組血清中TNF-α水平有明顯減低的趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，Tim-4過表達(dá)的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7-Tim-4可能通過抑制TNF-α的產(chǎn)生顯

7、著減輕ConA誘發(fā)的小鼠急性肝損傷。這與我們的體外研究結(jié)果一致。由于ConA誘發(fā)的小鼠急性肝損傷模型很好地模擬了人類病毒性肝炎、自身免疫性肝病等疾病，所以這也為Tim-4用于此類疾病的治療提供了可能。然而，Tim-4分子抑制巨噬細(xì)胞功能的具體分子機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)通路還有待于進(jìn)一步深入研究和探討。 脂肪性肝?。╢atty liver disease，F(xiàn)LD）是由一種或者多種誘因引起的以肝臟脂類物質(zhì)（一般是甘油三脂）蓄積為病理改變的肝

8、臟疾病，是最常見的彌漫性肝病之一，特別是在酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝和HCV感染的慢性病毒性肝炎中。脂肪性肝病并不是一種良性的病變，而是脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的前期病理改變。流行病學(xué)研究顯示脂肪肝在我國的發(fā)病率是5.2％～11.4％，發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。然而，脂肪肝的確切發(fā)病機(jī)制并不完全明了。近年來的研究表明，無論是酒精性脂肪肝還是非酒精性脂肪肝，其發(fā)病均受遺傳因素與環(huán)境因素的雙重影響，為一種常見的多基因遺傳病。因此

9、，易感基因的研究有助于闡明FLD的發(fā)病機(jī)制，有助于FLD的診斷和治療。 TRAIL（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand）是1995年由Wiley發(fā)現(xiàn)并克隆的腫瘤壞死因子（TNF）家族新成員。近年來的研究表明，在HCV感染和酒精吸入后脂肪肝患者的肝臟中，TRAIL基因的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組；而且TRAIL表達(dá)的升高可增加HCV和酒精對(duì)肝臟造成損傷的敏

10、感性。因此，TRAIL基因被認(rèn)為是人類脂肪肝病可能的易感基因。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，中國山東漢族人群TRAIL基因第五外顯子3’-UTR區(qū)1525G/A、1595C/T多態(tài)位點(diǎn)與脂肪肝的發(fā)病密切相關(guān)。2004年，Alexandra Weber等人發(fā)現(xiàn)，在歐洲人群中TRAIL基因啟動(dòng)子區(qū)-707、-665、-621和-597位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性。因此本研究擬通過病例對(duì)照分析來探討中國山東漢族人群TRAIL基因啟動(dòng)子區(qū)四個(gè)單核苷酸多態(tài)性與

11、脂肪肝易感性之間的關(guān)系。 本研究以明確診斷為脂肪肝的患者109例（非酒精性42例、酒精性67例），以及年齡與性別與病例組相匹配的132例正常對(duì)照個(gè)體作為研究對(duì)象。抽取外周靜脈血，提取DNA，用聚合酶鏈-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析方法和四引物法聚合酶鏈（Tetra-primer ARMS-PCR）反應(yīng)方法，對(duì)TRAIL基因啟動(dòng)子區(qū)的四個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)--707C/T、-665T/C、-621C/T和-597A

12、/G的基因型在中國山東漢族人群中進(jìn)行了檢測(cè)。四個(gè)位點(diǎn)均符合遺傳平衡規(guī)律。聚合酶鏈-限制性片段長度多態(tài)性分析、四引物法聚合酶鏈反應(yīng)分析以及測(cè)序結(jié)果都顯示，-707C/T、-665T/C和-597A/G位點(diǎn)在中國山東漢族人群中均未檢測(cè)到單核苷酸多態(tài)性；-621C/T位點(diǎn)在中國山東漢族人群中存在單核苷酸多態(tài)性，該位點(diǎn)CC/CT/TT基因型頻率在非酒精性脂肪肝、酒精性脂肪肝以及正常對(duì)照組中分別為0.238/0.500/0.262、0.269/0