線粒體DNA D-loop區(qū)單核苷酸多態(tài)性與上皮性卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、目的:線粒體基因（mitochondrial DNA，mtDNA）是唯一的核外遺傳物質(zhì)。而線粒體是真核生物中重要的細(xì)胞器，被稱為細(xì)胞的“能量工廠”，這就決定了mtDNA處于氧自由基產(chǎn)生的場(chǎng)所，使其更易受到攻擊，且與核基因相比，缺乏組蛋白的保護(hù)，因此mtDNA更易出現(xiàn)基因損傷畸變，進(jìn)而累積導(dǎo)致細(xì)胞的腫瘤變。因此，mtDNA廣泛存在于腫瘤及其相關(guān)疾病。
　　人類的mtDNA是一個(gè)長(zhǎng)約16569bp的雙鏈核苷酸封閉環(huán)，由兩條不對(duì)稱的核苷

2、酸鏈組成，即重鏈（H鏈）和輕鏈（L鏈）。mtDNA共包含了37個(gè)結(jié)構(gòu)編碼基因，編碼了13個(gè)氧化磷酸化相關(guān)多肽和22個(gè)tRNA，其中28個(gè)位于重鏈，其余位于輕鏈。mtDNA的非編碼區(qū)主要位于D環(huán)(displaceloop，D-loop)，由三個(gè)高變區(qū)(Hypervariable region，HVRⅠ，HVRⅡ，HVRⅢ)組成，是mtDNA復(fù)制的起始點(diǎn)所在，包含了兩條鏈的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和重鏈的復(fù)制起始點(diǎn)，因此D-loop又稱之為mtDNA的控

3、制區(qū)，在mtDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起著重要的作用。目前，研究表明該區(qū)域基因突變與多種實(shí)體腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，如頭頸部腫瘤，肝癌，食管癌等。但是關(guān)于此片段基因位點(diǎn)多態(tài)性與上皮性卵巢癌的發(fā)病率與預(yù)后相關(guān)性研究很少，因此，本課題以此為切入點(diǎn)通過(guò)測(cè)定卵巢癌組織中線粒體DNA D-loop區(qū)基因序列，分析該片段單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）與上皮性卵巢癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)性，并分析患者臨床特征和預(yù)后的

4、關(guān)系以期為上皮性卵巢癌的個(gè)體化治療及預(yù)后評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，。
　　方法:
　　1研究對(duì)象及隨訪選取2005年1月-2009年12月期間在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科行手術(shù)治療，術(shù)后病理證實(shí)為上皮性卵巢癌且術(shù)前均未接受任何相關(guān)激素治療及新輔助化療的患者，詳細(xì)記錄患者相關(guān)臨床資料，通過(guò)門診復(fù)查、電話、信件隨訪患者上皮性卵巢癌術(shù)后的生存情況，隨訪截止時(shí)間為2012年12月。
　　2 mtDNA的提取、擴(kuò)增及測(cè)序:利用QIGEN提

5、取石蠟組織中DNA試劑盒提取標(biāo)本DNA組，鑒定合格后，設(shè)計(jì)上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)后進(jìn)行測(cè)序，同一標(biāo)本采用雙向重復(fù)測(cè)序。
　　3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用IBM SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-Rank法比較單因素生存期的差異，用COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)多個(gè)預(yù)后影響因素進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1對(duì)89例上皮性卵

6、巢癌患者的mtDNA D-loop區(qū)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行單因素生存分析，結(jié)果顯示位于309 C/T，324 C/G，446 C/A SNPs與患者預(yù)后相關(guān)。309位點(diǎn)C基因型與T基因型的3年生存率分別為69.88％、33.33％，C基因型的患者預(yù)后優(yōu)于T基因型(P=0.021);324位點(diǎn)C基因型與G基因型的3年生存率分別為69.88％、33.33％，C基因型的患者預(yù)后優(yōu)于G基因型（P=0.004）;446位點(diǎn)C基因型與A基因型的3年生

7、存率分別為69.05％、40％，C基因型的患者預(yù)后優(yōu)于A基因型(P=0.044)。
　　2對(duì)89名上皮性卵巢癌患者的臨床特征與預(yù)后進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示病理類型（漿液性腺癌、粘液性腺癌、子宮內(nèi)膜樣腺癌、其他，P=0.559）、術(shù)后是否接受化療（是、否，P=0.097）與患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)聯(lián)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，年齡（≦55歲、＞55歲，P=0.035）、FIGO分期(Ⅰ-Ⅱ、Ⅲ-Ⅳ，P=0.013)、殘余病灶大?。ǎ?cm、＜1cm，

8、P=0.049）均與患者預(yù)后有明顯關(guān)聯(lián)性。
　　3將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的預(yù)后影響因子納入COX模型多因素分析中，結(jié)果示FIGO分期、309 C/T、324 C/G是影響上皮性卵巢癌預(yù)后的獨(dú)立因素(P＜0.05)，95％可信區(qū)間依次為1.050-8.577、1.369-12.058、1.849-17.181，Ⅲ-Ⅳ期患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是Ⅰ-Ⅱ患者的2.929倍;309位點(diǎn)T基因型患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是C基因型患者的4.063倍;324位

9、點(diǎn)G基因型患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是C基因型患者的5.636倍。
　　4對(duì)89例上皮性卵巢癌患者的mtDNA D-loop區(qū)SNPs與患者發(fā)病年齡進(jìn)行分析，結(jié)果顯示248 A/G，524 C/del和16304T/C單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)與患者發(fā)病年齡相關(guān)。248位點(diǎn)G基因型患者發(fā)病年齡早于常見基因型A基因型患者;524位點(diǎn)del基因型患者發(fā)病年齡晚于常見基因型（C基因型）患者，16304位點(diǎn)C基因型患者發(fā)病年齡早于T基因型患者。
　　結(jié)論

10、:
　　1 mtDNA中D-loop區(qū)位于309，324，446位點(diǎn)的SNPs與患者預(yù)后相關(guān)，其中309 C/T，324 C/G的可作為影響上皮性卵巢癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，兩者均是C基因型患者的預(yù)后較好。D-loop區(qū)基因多態(tài)性有望成為評(píng)估上皮性卵巢癌患者預(yù)后的新指標(biāo)，指導(dǎo)臨床治療和個(gè)體預(yù)后評(píng)估。
　　2上皮性卵巢癌患者的年齡、臨床FIGO分期、殘余病灶大小均與患者預(yù)后有明顯關(guān)聯(lián)性。其中臨床FIGO分期可作為影響上皮性卵巢癌