線粒體DNA COX基因單核苷酸多態(tài)性與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、目的：胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率較高，晚期預(yù)后差，嚴(yán)重危害了人類的生命健康。近年來，關(guān)于線粒體DNA突變及其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)與腫瘤生成的研究備受關(guān)注。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是細(xì)胞核外唯一的遺傳物質(zhì)，編碼參與氧化磷酸化和ATP生成所需要的多肽，由于本身缺乏組蛋白的保護(hù)、缺少有效的基因修復(fù)系統(tǒng)等原因，相比于核

2、基因組，mtDNA更易于受到氧化損傷而致突變。mtDNA由編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分組成，其編碼區(qū)包含13種多肽編碼基因、2種rRNA基因和22種tRNA基因，而D-Loop區(qū)是mtDNA的唯一非編碼區(qū)。COX基因作為mtDNA編碼區(qū)的基因之一，其編碼產(chǎn)物（COXⅠ-Ⅲ亞基）是細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome oxidase, COX）的重要組成部分。細(xì)胞色素氧化酶是線粒體呼吸鏈傳遞中的關(guān)鍵酶，其編碼基因的突變和多態(tài)性可能與腫瘤發(fā)生相關(guān)

3、。本研究通過對胃癌患者及正常人群的COX基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，發(fā)現(xiàn)與胃癌發(fā)病相關(guān)的SNPs位點，然后將這些位點SNPs與患者臨床特征進(jìn)行對比分析，以探究COX基因SNPs與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為胃癌的早期診斷和治療提供新思路。
　　方法：
　　1.研究對象及標(biāo)本采集：
　　病例組為100例胃癌患者，均為2007年5月-2008年8月于河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院外三科行根治術(shù)的病人，所有患者手術(shù)前均行胃鏡檢查、咬取組織

4、送病理化驗診斷為胃癌。對照組為2013年9月-2014年6月期間在河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院體檢的100例健康人。分別留取胃癌患者及正常人的外周靜脈血標(biāo)本3ml，觀察并記錄胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小等臨床特征，同時全面記錄對照組人群的體檢資料。
　　2.線粒體DNA提?。菏褂肈NA提取試劑盒分別提取胃癌患者及正常對照組人群外周靜脈血的線粒體DNA，經(jīng)DNA定量檢測合格后，置于零下20℃冰箱中長期保存?zhèn)溆谩?br>　　3.線粒體D

5、NA COX基因的擴(kuò)增及測序：通過查閱文獻(xiàn)得知COX基因包括COXⅠ、COXⅡ和COXⅢ三段基因，我們把整個COX基因按約600bps大小分成9個小基因片段(見Table2)，然后給每段基因片段設(shè)計上下游引物，之后再采用PCR技術(shù)對每段基因片段進(jìn)行DNA擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物首先經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，然后采用凝膠成像系統(tǒng)檢驗DNA條帶擴(kuò)增情況，若DNA條帶擴(kuò)增良好，將該樣品送至生物科技有限公司（北京）進(jìn)行測序。
　　4.統(tǒng)計分析：對

6、于計數(shù)資料，采用χ2檢驗進(jìn)行比較；對于計量資料，當(dāng)n<30例時采用t檢驗，n≥30例采用u檢驗。采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.胃癌組的年齡、性別與正常對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05)，說明兩組資料均衡可比。
　　2.在胃癌組及對照組中隨機(jī)選出28例標(biāo)本DNA進(jìn)行整段COX基因的擴(kuò)增和測序，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)6392T/C、6455C/T、6962G/A、

7、7196C/A、7853G/A、9540T/C、9548G/A、9824T/C、9950T/C9個高頻率多態(tài)性位點（出現(xiàn)頻率>5％）。將以上9個多態(tài)性位點的分布頻率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理后，可以看出胃癌組9540T/C位點的SNPs分布頻率相比于對照組有臨界性差異(χ2=3.541， P=0.06)，同時9548G/A位點在病例組與對照組間的分布頻率（χ2=1.409， P=0.235）也可能具有統(tǒng)計學(xué)意義，這兩個位點的SNPs分布頻率可能與胃

8、癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。
　　3.將9540T/C及9548G/A所屬基因片段的病例數(shù)增加至100例，發(fā)現(xiàn)9540T/C位點的SNPs與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.504， P=0.034），另外發(fā)現(xiàn)9548G/A位點SNPs在病例組和正常對照組間的分布頻率同樣具有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=4.188，P=0.041）。
　　4.分別將9540T/C、9548G/A兩個位點SNPs分布頻率和胃癌患者的臨床特征進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，

9、這兩個位點SNPs與胃癌患者臨床特征，包括年齡、性別、腫瘤長徑、腫瘤分化程度、腫瘤分期、脈管瘤栓及神經(jīng)受侵等均無關(guān)（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.mtDNA編碼區(qū)COX基因上的9540T/C、9548G/A兩個位點SNPs與胃癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，9540C基因型可能降低了胃癌的發(fā)病風(fēng)險，而9548A基因型可能增加了胃癌的發(fā)病風(fēng)險。
　　2.COX基因的9540T/C、9548G/A兩位點的SNPs與胃癌患者臨床特征