死亡抵抗蛋白DRP對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控作用.pdf

1、死亡抵抗蛋白(Death-resistantprotein，DRP)是本室于1998年從人樹突狀細(xì)胞cDNA文庫中分離出的一個(gè)新的全長cDNA，已在GenBank登錄，登錄號(hào)為AF077599。在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)NF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死及凋亡有顯著的抑制作用，因此，我們根據(jù)其主要的功能提示將其命名為死亡抵抗蛋白(DRP)。國外學(xué)者于2002年左右也報(bào)道了該分子并將它稱為Nrdp1(neuregulinreceptordeg

2、radationprotein-1)/FLRF(fetalliverringfingerprotein)/RBCC(ringfinger,B-box，coiled-coilprotein)。本室前期的研究顯示，在小鼠內(nèi)，DRP主要優(yōu)勢(shì)表達(dá)于小鼠的造血細(xì)胞以及造血前體細(xì)胞；在人體內(nèi)，DRP主要表達(dá)于心臟、大腦、骨骼肌和胰腺。目前已報(bào)道的研究顯示DRP主要是作為泛素連接酶(ubiquitinligase)參與細(xì)胞增殖和活化的調(diào)控。我們前期的

3、研究工作表明DRP可以顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的L929成纖維細(xì)胞的細(xì)胞壞死及凋亡(apoptosis)，主要的作用機(jī)制是抑制TNF-α誘導(dǎo)的JNK1/2(c-JunN-terminalkinase)的活化和后續(xù)的線粒體的凋亡相關(guān)變化，作用的模式可能是作為腫瘤壞死因子相關(guān)因子(tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor，TRAF)樣的分子拮抗TRAF-2的作用。由于考慮到DRP是一個(gè)TRAF樣

4、的分子，同時(shí)TRAF家族的成員TRAF6參與了TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)且均具有重要作用，因此我們推測(cè)DRP可能對(duì)LPS/TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有一定的調(diào)控作用，本課題對(duì)DRP在TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)控作用及其機(jī)制進(jìn)行了探討。 一、小鼠DRP的克隆和表達(dá)調(diào)控我們使用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的cDNA克隆了小鼠DRP(mouseDRP,mDRP)的全長核苷酸序列(GenBankNo.AF305730)，并且將該正確克隆作為

5、真核載體構(gòu)建的模板來源，該克隆所編碼的蛋白質(zhì)與人源DRP蛋白序列的同源性高達(dá)99％。分別采用LPS和TNFa處理小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系，觀察RAW264.7中不同時(shí)間小鼠DRP的表達(dá)情況。定量PCR的分析結(jié)果表明，在LPS(100ng/ml)刺激后4小時(shí)，mDRP的mRNA水平升高，6小時(shí)達(dá)到最高，12-24小時(shí)恢復(fù)至本底水平。用50ng/mlTNFa刺激巨噬細(xì)胞后，mDRP的變化升高趨勢(shì)類似，但其在刺激6小時(shí)時(shí)的增強(qiáng)程度不

6、如LPS刺激時(shí)升高得明顯。這種誘導(dǎo)性表達(dá)的性質(zhì)提示DRP可能參與LPS和TNFa的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控。 二、過表達(dá)DRP對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控利用小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7為細(xì)胞模型，我們研究了DRP在巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。我們構(gòu)建了mDRPpcDNA3.1真核表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，采用新霉素篩選的方法，建立了穩(wěn)定表達(dá)全長mDRP的細(xì)胞系(RAW-DRP)。分別采用RT-PCR和Wester

7、nblotting的方法鑒定了以上穩(wěn)定過表達(dá)DRP的RAW264.7細(xì)胞株RAW-DRP。為了研究DRP是否在LPS誘導(dǎo)的TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起一定的作用，我們首先觀察了DRP對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。DRP過表達(dá)后，能夠顯著地抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-6的分泌，也抑制IL-1β的分泌。與此同時(shí)，過表達(dá)DRP增強(qiáng)了LPS誘導(dǎo)的IFN-β的分泌。 我們觀察了過表達(dá)DRP對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞絲裂原

8、活化的蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)包括ERK(extracellularsignal-regulatedkinase)、JNK和p38活化的影響。與對(duì)照相比，DRP過表達(dá)顯著地增強(qiáng)了ERK和JNK的磷酸化，但對(duì)p38的磷酸化無明顯影響。隨后我們觀察了過表達(dá)DRP是否影響NF-κB(nuclearfactorκB)的信號(hào)活化，我們研究了NF-κB的調(diào)節(jié)激酶I-κB的磷酸化以及隨后的NF

9、-κB的轉(zhuǎn)錄活性變化。結(jié)果顯示，過表達(dá)DRP增強(qiáng)了LPS誘導(dǎo)的I-κBa的磷酸化，但抑制了NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。因?yàn)镈RP還增強(qiáng)了LPS誘導(dǎo)的IFN-β的分泌，后者主要受轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子(interferonregulatoryfactor3，IRF3)的調(diào)控，我們檢測(cè)了IRF3的活化情況。在LPS刺激后1小時(shí)，相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，RAW-DRP中IRF3的磷酸化增強(qiáng)。因此，我們認(rèn)為過表達(dá)DRP通過增強(qiáng)IRF3的活化從而增加了IFN-

10、β的分泌。 三、干擾DRP表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控我們用RNA干擾技術(shù)(RNAinterferencing)設(shè)計(jì)了特異性針對(duì)mDRP的干擾引物，構(gòu)建真核干擾載體，將其轉(zhuǎn)入RAW264.7細(xì)胞，并利用該載體所攜帶的新霉素抗性基因，穩(wěn)定篩選得到DRP干擾的穩(wěn)定株。經(jīng)RT-PCR和定量PCR檢測(cè)證明其干擾效率達(dá)到7080％。將LPS分別刺激穩(wěn)定干擾DRP的RAW264.7細(xì)胞1、4、8、12小時(shí)，提取細(xì)胞RNA，在mRNA

11、水平經(jīng)RT-PCR和定量PCR檢測(cè)細(xì)胞因子變化。其結(jié)果與過表達(dá)DRP的結(jié)果相反：RT-PCR結(jié)果顯示IL-6及IL-1β表達(dá)水平增加，IFN-β表達(dá)水平減少。在蛋白水平用ELISA方法檢測(cè)到IL-6分泌水平明顯增加。穩(wěn)定干擾DRP后的RAW細(xì)胞對(duì)LPS刺激的信號(hào)通路的改變與過表達(dá)DRP的結(jié)果也相反：與對(duì)照相比，干擾DRP后抑制了LPS誘導(dǎo)的ERK、JNK及P38的活化，抑制了LPS誘導(dǎo)的I-κBa的磷酸化，但增強(qiáng)了NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。

12、此外IRF3的磷酸化及細(xì)胞核分布的水平也表現(xiàn)為減少，提示抑制DRP表達(dá)可以抑制IRF3的活化和相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)死亡抵抗蛋白DRP參與了巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控作用，能夠抑制TLR4介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)增強(qiáng)了IFN-β的產(chǎn)生。由于TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路總體上可以分為髓系分化蛋白88(Myeloiddifferentiationprotein88，MyD88)依賴的(MyD88-dependent)

13、和MyD88非依賴(MyD88-independent)的通路，前者主要與MAPK和NF-κB的活化以及炎性因子的產(chǎn)生相關(guān)，后者主要與IRF3的活化和IFN-β的產(chǎn)生相關(guān)，因此，根據(jù)現(xiàn)有的結(jié)果我們推測(cè)DRP可以抑制MyD88依賴通路的活化并且同時(shí)促進(jìn)MyD88非依賴通路的活化，在LPS觸發(fā)的TLR4的信號(hào)通路中可能作為兩條通路的開關(guān)樣(switch)分子，參與決定兩條通路的活化方向。我們的研究對(duì)于進(jìn)一步了解TLR4信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制、特