犬瘟熱DNA疫苗的構建及免疫實驗的研究.pdf

1、犬瘟熱病毒(CDV)屬于副粘病毒科(family Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(genus Morbillivirus)成員，為有囊膜的負鏈線性RNA病毒，自然條件下犬瘟熱病毒感染食肉目中犬科、鼬科、浣熊科等多種動物，貓科動物也可感染。是當前對養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)和野生動物保護業(yè)危害最大的疾病之一。 防治犬瘟熱的有效途徑是疫苗接種，雖然滅活疫苗和弱毒疫苗在控制犬瘟熱發(fā)生上起了一定作用，但隨著使用的廣泛，也發(fā)現了許

2、多缺陷，弱毒苗可引起免疫抑制和中樞神經系統(tǒng)的損壞；隨著CDV宿主譜日趨擴大，弱毒疫苗的使用還可能致死某些易感動物并帶來散毒的危險。此外，CDV本身的變異也可能導致疫病的流行。因此，必須尋找更安全、有效、實用的新型疫苗。基因疫苗和重組活載體疫苗是近年來研究比較熱的新型疫苗，在預防免疫方面也取得很大進展。 最新研究表明CDV融合蛋白(F)和血凝素(H)蛋白是宿主免疫系統(tǒng)的主要目的抗原，是產生中和抗體的重要抗原之一。核衣殼(N)蛋白是

3、保守性較強的免疫原性蛋白，此外N蛋白上含有T細胞表位。H，F和N蛋白在犬瘟熱的免疫預防方面起重要作用。 為了研制新一代安全、高效的CDV基因工程疫苗，本研究根據GeneBank己發(fā)表的犬瘟熱病毒H、F和N基因序列，設計四對特異引物，經RT-PCR擴增后，連接到pMD18-T載體，序列測定證明各基因序列正確。然后將各基因亞克隆到真核表達載體pIRESlneo中，構建成四種重組真核表達質粒，經過Western-blot鑒定證明各重組

4、質粒可以表達相應的目的蛋白。之后以構建的真核表達質粒pIRES H、pIRES F、pIRES Nl和pIRES N2為基因疫苗，進行了小鼠和貉子的動物免疫試驗，對免疫鼠和貉子體內免疫應答水平進行了ELISA檢測，并對貉子進行了攻毒保護實驗。結果顯示：所構建的基因疫苗可以誘導小鼠和貉子產生特異性免疫應答反應，雖然貉子在經過三次基因免疫后仍不能完全抵抗強度攻擊(保護率為33％到100％不等)，但弱毒疫苗也有貉子攻毒后死亡，不能對貉子產生完